简介

作为天然免疫细胞的重要组成部分，中性粒细胞的作用在炎症发生的过程中发挥着重要作用。要探讨其机制，常需分离小鼠腹腔以及外周血中性粒细胞和人外周血中性粒细胞进行研究。

但是，若未经诱导，从一只小鼠腹腔内能分离到的中性粒细胞少于106，因此，若需要制备大量中性粒细胞，则需要进行诱导。

目前，诱导分离中性粒细胞的方法有 Percoll 密度梯度分离法和蔗聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法等。

原理

Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞的基本原理是利用 Percoll 渗透压低（＜20 mOsmol／kgH₂0），黏度小，形成的梯度非常稳定，可高达 1.3 g／mL 密度。采用预先形成的密度梯度可在低离心力（200～1000 g ）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于 Percoll 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。而且 Percoll 不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。 蔗聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离中性粒细胞的基本原理是利用右旋糖酊加速红细胞沉降，将富含白细胞的上层液用淋巴细胞分层液进一步分 离，使粒细胞沉于管底，从而使之与淋巴细胞和单核细胞分离。再用低渗裂解法裂解红 细胞后，即得到中性粒细胞。该方法主要用于小量制备中性粒细胞。

操作方法

Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞

简介

Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞对细胞无毒害，广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

原理

Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞的基本原理是利用 Percoll 颗粒渗透压低（＜20mOsmol／kgH20），黏度小，梯度稳定，采用预先形成的密度梯度可在低离心力（200～1000 g ）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于 Percoll 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。

材料与仪器

试剂：

1．酪蛋白。

2.1xPBS（pH7.2，含 0.9 mmol／L CaCl2 以及 0.5 mmol/L MgCl2)。 

3.1xPBS（含 0.02％EDTA）。 

4.70％ 乙醇。

5．Percoll 分层液由 10 mL 10xPBS（pH7.2）加入 90 mL Percoll 原液配制。

仪器：

1.10 mL 注射器。

2．小的外科剪、镊子。

3. 15 mL 或 50 mL 聚丙烯离心管。

4．离心机。

5. 10 mL 超速离心管

步骤

 Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞的基本过程可分为以下几步： 1．配制酪蛋白液 将 9 g 酪蛋白缓慢加入 100 mL 热的 1xPBS（pH 7.2，含 0.9 mmol／L CaCl2 及 0.5 mmol／L MgCl2），同时摇动容器。125℃ 高压灭菌 1 小时，4℃ 保存 1～2 周，在使用前加热至室温。

2．制备小鼠腹腔细胞

（1）用 10 mL 注射器将 1 mL 酪蛋白液注射至小鼠腹腔，第二天重复注射一次。

（2）第二次注射后 3 小时用 70％ 乙醇消毒小鼠腹部，暴露腹壁。 （3）用 10 mL 注射器（21 号针头）将 5 mL 1xPBS（含 0.02％EDTA）注射至小鼠腹腔。 （4）轻揉小鼠腹部，然后用同一个注射器轻轻将腹腔液吸至 15 mL 离心管。 （5）若需制备更多细胞，可重复以上（3）和（4）多次。 （6）1000 r ／min 或 200 g 离心 10 分钟，弃上清，用 1xPBS 洗 3 遍后收集细胞。 （7）将细胞悬浮于 1 mL 室温 1xPBS 中，通过锥虫蓝染色检查细胞活力。 3．通过连续密度梯度离心法分离中性粒细胞 （1）将 1 mL 收集的腹腔细胞（5x107／mL）与 9 mL Percoll 置于 10 mL 超速离心管中混合。

（2）超速离心混合液（4℃，25700 r ／min 或 60650 g），吸弃含有巨噬细胞和淋巴细胞的第一层液体，收集第二层中的细胞（图 8-1）。

（3）将所获得的细胞加 1xPBS 10 mL，室温，200 g 离心 5 分钟，弃上清。 （4）通过锥虫蓝染色检查细胞活力后，计数细胞后根据需要用 PBS 或合适的培养基将细胞稀释备用。

Ficoll-hypaque 密度梯度离心法（分离中性粒细胞）

简介

Ficoll-hypaque 密度梯度离心法，又称蔗聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法，该方法主要用于小量制备中性粒细胞。

原理

Ficoll-hypaque 密度梯度离心法分离中性粒细胞的基本原理是利用右旋糖酊加速红细胞沉降，将富含白细胞的上层液用淋巴细胞分层液进一步分离，使粒细胞沉于管底，从而使之与淋巴细胞和单核细胞分离。再用低渗裂解法裂解红细胞后，即得到中性粒细胞。

材料与仪器

试剂： (1)6% 右旋糖酊生理盐水。 (2) 蔗聚糖-泛影葡胺分层液 (密度为 1.077)。 (3)0.83%NH4C1 溶液：＜0.83 g NH4C1, 0.1 g KHCO3.0.0037 gEDTA-2Na, 蒸馏水加至 100 mL (4)0.1% 白明胶 Hank's 溶液。 (5) 肝素 仪器： (1) 离心机 (2) 超速离心管。

步骤

蔗聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离中性粒细胞的基本过程可分为以下几步： 1. 红细胞沉降：取 4 mL 肝素抗凝血，加 l mL6% 右旋糖酊生理盐水 (相当于 1/4 体积抗凝血)，混匀后在室温斜置 30 ~45 min。 2. 分离中性粒细胞：取上层按 1：1 比例叠加到蔗聚糖-泛影葡胺分层液顶部。 500 r / min 离心 30 min, 弃上清。 3. 裂解红细胞：将细胞沉淀用 0. 83% NH4C1 溶液低渗法破除红细胞。 4. 收集中性粒细胞：离心洗涤细胞后，将细胞重悬于 2~3 mL0. 1% 白明胶 Hank's 溶液中，计数并调整细胞至所需浓度。 5. 活力及纯度测定：取细胞液涂片，分别作台盼蓝拒染试验和 Giemsa 染色鉴定其 存活率与纯度。