基于生物化学检测细胞凋亡

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简介

基于生物化学检测细胞凋亡是依据细胞凋亡生物化学特征检测细胞凋亡的方法。

目前,基于生物化学检测细胞凋亡的方法主要有 2 种:琼脂糖凝胶电泳法和 ELISA 法。

原理

基于生物化学检测细胞凋亡的基本原理是:

①细胞凋亡的主要生物化学特征是其染色质断裂,染色质 DNA 在活化的核酸内切酶作用下,首先降解为 200~300kb 的片段。然后,DNA 片段在核小体单位之间连接处断裂,形成 180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段。坏死细胞内的 DNA 则是被随机降解为任意长度的片段。因此,通过提取细胞 DNA 进行电泳,可以分析细胞是否发生凋亡或坏死;

②由于凋亡 DNA 双链断裂或是一条链上出现缺口,就会产生 3'-OH 末端,而正常细胞以及正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂,所以没有 3'-OH 末端形成。因此,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)的作用 下,将荧光素、地高辛或生物素等标记的脱氧三磷酸尿苷(deoxyuridinetriphate,dUTP)连接到凋亡细胞染色体 DNA 的 3'-OH 末端,经激发光激发或酶联免疫反应等可以检测连接标记的脱氧一磷酸尿苷的多少,判断细胞的凋亡情况;

③细胞凋亡过程伴随许多特异性相关蛋白的降解及释放,如多聚(ADP-核糖)聚合酶 [poly(ADP-ribose)polymerase,PRAP] 降解、Caspase 酶原 的激活以及细胞色素 C 释放等,成为细胞凋亡的重要标志分子。因此,通过免疫印迹技术或酶动力学可检测这些蛋白的有无判断细胞凋亡。

操作方法

琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡(基于生物化学检测细胞凋亡)

简介

琼脂糖凝胶电泳法是判断细胞凋亡的经典方法。凋亡细胞在发生凋亡时,可产生多个大小 在 180 - 200 bp 或其多聚体组成的寡核昔酸片断,这些片段在进行琼脂糖凝胶电泳时,形成了特征性的梯状条带 (DNA ladders),其大小为 180 - 200 bp 的整数倍。

原理

琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡的基本原理是凋亡细胞 DNA 片段在核小体单位之间连接处断裂,形成 180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段,在琼脂糖凝胶电泳图谱上表现为阶梯状条带(DNA ladder)。

坏死细胞内的 DNA 则是被随机降解为任意长度的片段,其 DNA 降解产物在电泳图谱上呈现弥漫的条带。对凋亡细胞采用常规方法分离提纯 DNA 后,进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶(ethidium Bromide,EB)染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的 DNA ladder。

材料与仪器

器材:CO2 培养箱、生物安全柜、水平电泳槽及电泳仪、恒温水浴箱、正视显微镜及离心机、凝胶图像分析系统。   试剂:   ① 含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养液。 ② 地塞米松磷酸钠注射液。 ③ 1 kb plus DNA ladder。 ④ 细胞裂解液(10 mmol/L Tris-HC1,pH8.0,10 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA,100μg/ml 蛋白酶 K,10 mg/ml Rnase,1% SDS)。 ⑤ 苯酚/氯仿(1:1)、苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿。 ⑥ 3mol/L 乙酸钠,pH5.2。 ⑦ -20℃ 预冷的无水乙醇。 ⑧ TE 缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L ⑨ 100bp Ladder Marker。 ⑩ 50 x TAE 电泳缓冲液(Tris 242 g,醋酸 57.1 ml,0.5mol/L EDTA,pH8.0 100 ml,加蒸馏水至 1L)。 ⑪ 低熔点琼脂糖

 

步骤

琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡的的基本过程可分为如下几步,以检测小鼠脾细胞凋亡为例:

 

(一)DNA 提取

 

A 脾细胞分离:4 周龄 Balb/c 小鼠经麻醉后处死,无菌条件下取出脾脏,经机械研磨游离胸脾细胞,用预冷的裂解液将红细胞溶解,用 PBS 将脾细胞洗涤,最后悬浮于 10% FBS 的 RPMI 1640 培养液中,密度为 2x106/ml。 B 实验分组:凋亡组,于 6 孔细胞培养板中加胸腺细胞液 2 ml,加地塞米松溶液,补加含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养液至总体积 4 ml,地塞米松终浓度为 1μmol/L。混匀后,于 37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养 10 小时。阴性对照组,细胞培养液中不加地塞米松。 C 分别收集各组细胞,以 PBS 洗 1 次,800 g 离心 5 分钟。弃上清,加含蛋白酶 K 和 RNase 的细胞裂解液 500μl,混匀,50℃ 水浴 2 小时,不时振摇。以等体积的苯酚/氯仿(1:1)、苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)和氯仿各抽提一次。 D 收集上清移至另一离心管,加 0.5 ml 氯仿:异戊醇(24:1)抽提,混匀后 4℃、12000 r/min 离心 5 分钟。 E 移上清至另一离心管,加 100μl 的 3mol/L 乙酸钠和 1 ml 预冷无水乙醇,混匀后置-20℃ 过夜沉淀 DNA,4℃、12000 r/min 离心 10 分钟离心弃上清。 F 沉淀重新悬浮于 70% 乙醇,4℃、12000 r/min 离心 10 分钟,弃上清。置室温干燥 10 - 30 分钟,加 30μl TE 缓冲液溶解 DNA。于 260nm 和 280nm 测定 DNA 含量。

 

(二)电泳

 

A 制备含 EB(终浓度 0.2 μg/ml)的 1.6% 的琼脂糖凝胶,将胶移入到 1xTAE 缓冲液的电泳槽内。 B 取 5μl 样品溶液与等体积加样缓冲液混匀,依次上样,以 10V/cm 电泳 2 - 3 小时。 C 以双水脱色 1 小时,在紫外灯下观察。置凝胶成像系统中拍照分析。

 

(三)观察结果

 

凋亡细胞 DNA 提取物在电泳后呈现典型的 DNA 阶梯状条带,正常细胞 DNA 提取物在点样附近呈现出一条宽带,坏死细胞则为弥散状条带(图 19-4)。

 

 

注意事项

1.细胞裂解液中要有足够的蛋白酶 K 和 RNA 酶,消化时间可适当延长,使蛋白及 RNA 充分降解。RNA 酶经高温预处理灭活 DNA 酶。 2.加氯仿等提取液时要快速剧烈混匀,有利于蛋白变性沉淀。氯仿及苯酚具有一定的挥发性,对身体有一定的危害,操作时应在通风橱中进行。 3.电泳时上样量一定要合适,否则量少跑不出条带,量多则荧光太强条带分辨不清。 4.EB 具有潜在的致畸作用性,操作时要戴乳胶手套,注意防护。

 

ELISA 法检测细胞凋亡

简介

ELISA 法检测细胞凋亡是对凋亡细胞产生单/寡核小体进行高特异性、高敏感性的 定量检测。

原理

ELISA 法检测细胞凋亡的基本原理是细胞凋亡时产生的核小体可以与组蛋白 H2A、H2B、H3、H4 形成紧密复合物而不被 核酸内切酶裂解。

应用小鼠抗 DNA 和抗组蛋白的单克隆抗体,与核小体片段特异结合而 建立的双抗体夹心酶免疫法,可特异检测凋亡细胞溶解物中的核小体。

该法结合生物 素-亲和素放大系统,可实现对凋亡细胞产生的单/寡核小体进行高特异性、高敏感性的 定量检测。

材料与仪器

器材:链霉亲和素包被的微孔板,离心管,吸管,移液器等。
试剂:
① 生物素标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗体; ② 过氧化物酶 (POD) 标记的小鼠 抗 DNA 单克隆抗体; ③ DNA - 组蛋白复合物,作为对照; ④ ABTS 底物; ⑤ 溶解缓冲液; ⑥ 温育缓冲液; ⑦ 底物缓冲液。

步骤

ELISA 法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步:
A 取样品 1000 r/min 离心 10 min, 吸取 20μL 上清液,加入链霉亲和素包被的培 养板孔中。
B 加入 80μL 免疫反应试剂,含抗 DNA - POD、抗组蛋白-生物素及温育缓冲液 (按 1:18 混合),室温下孵育 2 h (置摇床上 250 r/min)。
C 去上清,加 300μL 温育缓冲液洗涤,小心移去洗涤液。
D 重复步骤 (3) 2 次。
E 加入底物缓冲液 100 μL, 摇床上室温孵育至颜色变化至合适。
F 用底物缓冲液作空白对照,比色检测其 0D 值 (10 - 20 min 内完成),检测波长 405 nm, 参考波长为 492 nm。

G 结果分析:按以下公式计算细胞产生的单/低聚核小体片段的聚集值:



注意事项:mU (吸收值)=双孔吸收值的平均 0D 值 - 底物 0D 值。

注意事项

1. 加入底物后,尽快检测。
2. 若样品的 0D 值过高,应对样本做适当稀释后再行检测。
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THE END
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