抗体纯化实验

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简介

抗体纯化实验是用于纯化免疫血清中的抗体。目前,用于抗体纯化的方法主要有 6 种:盐析法、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析和高效液相色谱。

原理

盐析法提纯抗体的基本原理是在蛋白质溶液中加入大量的中性盐(如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出,沉淀不同蛋白质所需盐浓度及 pH 值不同。

凝胶柱层析法提纯抗体的基本原理是凝胶本身是一种多孔网状结构分子筛,其线性基质含多个羟基,具有亲水性,在交联剂作用下交联形成不溶于水的三维空间网络结构,常用葡聚糖(sephadex)或琼脂糖(sepharose)类物质。

当蛋白质溶液流经凝胶柱时,大分子蛋白质不能穿过凝胶网孔进入凝胶粒内部,因此留在胶粒间隙的溶液中,随洗脱液最先流出。而小分子蛋白质则进入胶粒内部,由于受到胶粒阻留,流速较慢,即可根据蛋白质分子量大小不同,将蛋白质组分由大到小依次分离出来(图 1-1)

操作方法

盐析法提纯抗体

简介

盐析法提纯抗体是在蛋白质溶液中加入大量的中性盐破坏蛋白质周围亲水基团与水形成的水化膜及其所带电荷的稳定使抗体析出。

材料与仪器

器材:磁力搅拌器,低温冰箱,4℃ 离心机,电子天称,紫外分光光度计,烧杯,透析袋,精密 pH 试纸(pH5.5-9.0),转子,离心管,移液器。
试剂:
①饱和硫酸铵溶液:称取 400-425 g 分析纯 (NH4)2SO4,以 80-100℃ 双蒸水 500 ml 溶解(表 1-2),磁力搅拌器充分搅拌直至所加入的硫酸铵全部溶解,趁热过滤,滤纸可用 125μm 规格。冷却后以浓氨水(15mol/L NH2OH)调 pH 值至 7.4。配制好的饱和硫酸铵,瓶底应有大量结晶析出,保存于室温;
②0.9% 氯化钠溶液(生理盐水);
③0.15mol/L、pH7.4 磷酸缓冲盐液(phosphate buffered saline,PBS):称取 8 g NaCl,0.2 g KCl,2.9 g Na2 HPO4•112 H20,0.2 g KH2PO4 溶于 1000 ml 双蒸水 中,用 HCl 调 pH 至 7.4,保存于室温;
④萘氏试剂:称取 11.5 g HgI2,8 g KI,加双蒸水至 50 ml,搅拌溶解后,再加入 20%NaOH 50 ml


步骤

盐析法提纯抗体的基本过程可分为如下几步:
A 收集的血液装于适当容器并置 37℃ 温箱 1 小时,再置 4℃ 冰箱过夜,待血液凝固血块收缩后,吸出血清,以 4000r/min 离心 15 分钟,取上清,加入防腐剂(终浓度 0.01% 硫柳汞或 0.02% 叠氮钠),或加入等量中性甘油,分装后置-20℃ 或-80℃ 冰箱中保存备用。
注意事项:抗体应避免反复冻融,效价可保持 2 年以上。也可将抗血清冷冻干燥后长期保存,但在干燥过程中抗体效价可能会丢失一部分。
B 10 ml 免疫血清加等量生理盐水稀释,混匀后置磁力搅拌器上,边搅拌边逐滴加入 20 ml 饱和硫酸铵,使其终浓度为 50%。4℃ 放置 2 小时以上,使其充分沉淀。
C 4000r/min,4℃ 离心 30 分钟,弃上清。以 20 ml 生理盐水溶解沉淀,然后加入 10 ml 饱和硫酸铵,使其终浓度为 33%,4℃ 放置 2 小时以上。
D 重复上述第二步过程 2 次。将末次离心所得沉淀物以 4 ml 0.15mol/L pH7.4 PBS 溶解后,装入透析袋。
E 将透析袋放入 50-100 倍体积的 PBS 中,4℃ 充分透析除盐,期间至少换液 3 次以上,至萘氏试剂测透析外液无黄色。也可采用 Sephadex G-25 层析除盐,该法除盐较彻底、快速,但抗体浓度将被稀释。
F 取少量透析后样品适当稀释后,以紫外分光光度计检测蛋白含量,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测抗体纯度。蛋白含量还可通过如下公式进行计算:
蛋白含量(mg/ml)=(1.45xOD280 mm-0.74x OD260 mm)x 样品稀释度。
*注:计算公式中 1.45 与 0.74 为常数,nm 为波长。
E 分装抗体,置于-20℃ 或-80℃ 冰箱保存。


注意事项

1. 全部实验应在 20℃ 以下环境中进行,有些环节需在 4℃ 操作,如离心和透析过程,以防免疫球蛋白(Ig)变性和降解,确保抗体的活性。
2. 血清需稀释后再盐析,饱和硫酸铵加入应缓慢,均可避免杂质与抗体发生共沉淀,影响纯化抗体的纯度。
3. 蛋白质沉淀后宜在 4℃ 放置 2 小时以上或过夜,以形成较大沉淀而易于分离。
4. 溶液中的离子强度直接影响蛋白质的稳定性,不同蛋白发生沉淀的离子强度不同。因此,当硫酸铵的饱和度不同,从免疫血清中析出的蛋白成分就不同。如果盐析的免疫球蛋白来源于小鼠,则饱和硫酸铵终浓度以 45%-50% 为宜,过低会导致抗体的丢失,当饱和度为 33% 时 γ 球蛋白析出;当饱和度大于 50% 时,白蛋白及大多数拟球蛋白析出。


凝胶柱层析法提纯抗体

简介

凝胶柱层析法也称分子筛层析、排阻层析,是根据蛋白质分子量大小不同,将蛋白质组分由大到小依次分离出来。

材料与仪器

器材:层析仪 1 套;2.5x100 cm 层析柱;滤网(滤纸);1000 ml 烧杯;5 ml 吸量管;试管。
试剂:
① 0.05mol/L pH8.0 磷酸缓冲液(PB):0.2mol/L Na2HPO4 溶液 94.7 ml,0.2mol/L NaH2PO4 溶液 5.3 ml 混合后,蒸馏水稀释至 400 ml;
② Sephadex G-200 干胶 20 g;


步骤

凝胶柱层析法提纯抗体的基本过程可分为如下几步:
A 凝胶处理:Sephadex G-200 使用前应用水充分膨胀,一般需膨胀 72 小时。为节约时间,也可煮沸 2-4 小时,并重复漂洗 2-3 次。

B 装柱:柱内径和高度之比为 1:20-1:50 范围的层析柱,与蠕动泵、紫外监测仪相连,并向柱内加入 1/3 高度的缓冲液,将溶胀的 Sephadex G-200 凝胶用缓冲液调成糊状,沿柱内壁填充到柱内,待其部分自然沉降后,吸出部分上清,再加入凝胶,反复数次,直至凝胶距柱上口 6-8 cm,在凝胶上放一直径略小于柱内径的圆形滤纸片,使其平铺在凝胶柱面上。

目的是避免加样或加缓冲液时破坏凝胶柱界面的平整,并能防止样品中的颗粒进入凝胶柱。按 0.2 ml/min 流速,连续冲洗,使柱充分平衡后上样,Sephadex G-200 柱一般需平衡 4 小时以上。


C 加样:吸去滤纸片上层缓冲液,加入 2 ml 经饱和硫酸铵沉淀的抗体样品,待样品完全进人层析凝胶柱后,再加满洗脱缓冲液。
D 洗脱:用 0.05mol/L pH8.0 磷酸缓冲液,以 0.1 ml/min 速度洗脱,记录洗脱图谱,分步收集洗脱组分(2 ml/管)。
E 检测:收集的样品采用紫外分光光度计法检测蛋白含量,蛋白主峰为 IgG,可进一步检测 IgG 免疫学活性和纯度。


注意事项

1、装柱过程切忌有气泡和断层,若有断层,需倾倒出填料,重新装柱。
2、加样时,注意缓冲液界面恰好在滤纸片上,及时加样,不能出现因放液过快使凝胶柱干涸现象,否则凝胶不能继续使用。
3、整个层析过程时间较长,要求在 4℃ 环境中操作,以防蛋白活性下降。


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THE END
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