用新 RACE 法扩増 cDNA 的 5'末端

请关注公众号【叨客学习资料】 在使用网站的过程中有疑问,请来公众号进行反馈哦

简介

这一实验方案分为 6 个阶段。第 1 阶段:降解 RNA 的去磷酸化; 第 2 阶段:完整 RNA 去帽; 第 3 阶段:RNA 寡核苷酸的制备; 第 4 阶段:RNA 寡核苷酸与细胞 RNA 的连接; 第 5 阶段:反转录; 第 6 阶段:扩增。本实验来源于 PCR 实验指南(第二版),作者:种康,瞿礼嘉。

操作方法

用新 RACE 法扩増 cDNA 的 5'末端

材料与仪器

缓冲液、溶液和试剂 酶和酶缓冲液 核酸和寡核苷酸
特殊设备

步骤

第 1 阶段:降解 RNA 的去磷酸化

一、材料


1. 缓冲液、溶液和试剂

乙酸钠,3mol/L,pH5.2

乙醇

二硫苏糖醇(DTT)(0.1mol/L)

苯酚/氯仿(1:1,体积比)

2. 酶和酶缓冲液

磷酸酶缓冲液,10X

蛋白酶 K

RNasin

牛小肠碱性磷酸酶(CIP)

3. 核酸和寡核苷酸

RNA 样品

4. 特殊设备

预设为 37°C、50°C 的水浴或加热仪

5. 其他

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备,包括溴化乙锭

二、方法

一般来说,应该按照生产商的说明使用磷酸酶。

1.在一个无菌的离心管中混合以下成分。

RNA                              50ug

10X 磷酸酶缓冲液         5ul

DTT(100 mmol/L)         0.5ul

RNasin(40U/ul)             1.25ul
 
CIP(lU/ul)                      3.5ul

H2O                              至 50ul

2.50°C 溫育 1h。

3.加蛋白酶 K 至 50ug/ml,37°C 温育 30 min。

4.用苯酚/氯仿抽提反应物,然后用氯仿再抽提一次。用 l/l0 体积的 3mol/L 乙酸钠(pH5.2) 和 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀 RNA,用 43.6ulH20 重溶 RNA。

5.取 2ug(1.6ul) 的 RNA 跑 1% 的琼脂糖凝胶电泳(TAE),相邻的泳道点 2ug 的原始RNA 样品,用溴化乙锭染色,以确认 RNA 在去磷酸化步骤中仍然是完整的。

第 2 阶段:完整 RNA 去帽

一、材料


1. 缓冲液、溶液和试剂

ATP(100 mmol/L)

氯仿

乙酸钠,3mol/L,pH5.2

乙醇

苯酚/氯仿 (1:1, 体积比)

TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,lmmol/LEDTA、pH8.0)

2. 酶和酶缓冲液

RNasin

烟酸焦磷酸酶(TAP),5U/ul

TAP 缓冲液,10X

3. 核酸和寡核苷酸

第 1 阶段所得到的 RNA 样品

4. 特殊设备

预设为 37°C 的水浴或加热仪

5. 其他

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备,包括溴化乙锭

二、方法

1. 在一个无菌的离心管中混合以下成分。

RNA(由第 1 阶段第 5 步得到)38ul

TAP 缓冲液(10X)                    5ul

RNasin(40U/ul)                         1.25ul

ATP(100 mmol/L)                      1ul

TAP(5U/u1)                              1ul

H20                                          至 50ul

2.37°C 温育 1h, 然后加 200ul 的 TE。

3. 用苯酚/氯仿抽提反应物,然后用氯仿再抽提一次。用 1/10 体积的 3mol/L 乙酸钠(pH5.2) 和 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀 RNA, 用 40ulH20 重溶 RNA。

4. 取 2ug 的 RNA 跑 1% 的琼脂糖凝胶电泳(TAE),相邻的泳道点 2ug 的原始 RNA样品,用溴化乙锭染色,以确认 RNA 在去帽步骤中仍然是完整的。



第 3 阶段:RNA 寡核苷酸的制备

选择离 T7 或 T3RNA 聚合酶作用位点下游约 lOObp 处可以线性化的质粒 [见图 25-3(b)]。因为来自多克隆位点回文序列的引物用于 PCR 效果不好,因此比较理想的是用在多克隆位点克隆进某个插入片段的质粒。一个已经验证过的质粒是 pBS-SK-GBX-l-3'UTR,它是在 pBS-SK(Stratagene) 的 Sst I 位点克隆进了小鼠的 Gbx-1(Frohmanetal.1993) 基因的 3'非翻译区。它可以用 SmaI 线性化,并用 T3RNA 聚合酶转录,产生一段 132 个核苷酸的 RNA 寡核苷酸。除了 17 个寡核苷酸外,其他均来自 Gbx-1。需要注意,如果可以找到合适的酶切位点,腺苷酸是 3'末端寡核苷酸连接到靶序列 5'末端的最好的「受体」。后面扩增所用的引物都是 3'非翻译区的序列。Gbx-1 NRC 引物的序列和质粒可以向Frohman 实验室索取。要进行转录测试,以确保各种组分正常工作,然后再放大反应体系。寡核苷酸可以长期保存于-80°C 备用。由于纯化和斑点检查操作损失很大,因此合成足够的寡核苷酸是很重要的。

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

氯仿

乙醇

焦碳酸二乙酯(DEPC) 处理过的 H20

rUTP 溶液,10 mmol/L

rATP 溶液,10 mmol/L

rCTP 溶液,10 mmol/L

rGTP 溶液,10mmol/L

DTT(0.lmol/L)

苯酚/氯仿(1:1, 体积比)

乙酸纳,3mol/L,pH5.2

TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,lmmol/LEDTA、pH8.0)

2. 酶和酶缓冲液

合适的内切酶和相应的缓冲液

胰腺 DNA 酶 I(无 RNA 酶)

蛋白酶 K

依赖 DNA 的 RNA 聚合酶

RNasin

转录缓冲液, 5X ( 由制造商提供)

3 . 核酸和寡核苷酸

质 粒 模 板 DNA

4 . 特殊设备

合 适 规 格 的 Microcon 过 滤 器(见第 7 步)

预 设 为 37°C 的水浴或加热仪

5 . 其他

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备,包 括 溴 化 乙 锭

二、方法

1. 用合适的内切酶和缓冲液,线 性 化 25ug 的 质 粒 DNA, 以 用 于 转 录(质粒中要确保没 有 R N A 酶)。

2. 用 50ug/ m l 的 蛋 白 酶 K 于 37°C 消 化 处 理 30 min, 然后用苯酚/ 氯 仿 抽 提 两 次 ,氯仿再抽提一次。用标准的无水乙醇沉淀法收集 DNA。

3. 用 25ul 的 T E ( pH8 . 0 ) 重 溶 模 板 DNA, 其 终 浓 度 约 为 lug/ ul 。

4. 室温下,在一个灭菌的管中按下列顺序混合以下转录试剂。



    37°C 温育 1h

5. 转录之后,每 20ul 反应体积加 0.5ulDNA 酶(无 RNA 酶),37°C 温育 10min,以去掉 DNA 模板。

6. 取 5ul 验证反应或制备反应的产物,跑 1% 的琼脂糖凝胶电泳(TAE),以检測寡核苷酸产物。除在胶的上下都会有一些拖尾外,在产物的预期大小(或稍小)的位置,会有一条弥散的带。

7. 用苯酚/氯仿抽提,用氯仿再抽提,以纯化寡核苷酸。用水漂洗 3 遍,然后过 Microcon(Millipore) 过滤器(预先用水浸泡)。

Microcon30 过滤器的截留值为 60nt,Microcon100 过滤器的截留值为 300nt。如果寡核苷酸小于100nt, 则 MicroconlO 过滤器也许是最合适的。对于更大的寡核苷酸,可以用 Micrcon30 过滤器。

8. 另取一份适量的寡核苷酸样品,跑 1% 的琼脂糖凝胶电泳(TAE),检测样品的完整性和浓度。分装后保存于-80°C。

第 4 阶段:RNA 寡核苷酸与细胞 RNA 的连接

一、材料


1. 缓冲液、溶液和试剂

ATP,2 mmol/L

2. 酶和酶缓冲液

连接缓冲液,lX(500 mmol/LTris-HCl、pH7.9,100 mmol/MgCl2,20 mmol/LDTT,1mg/mlBSA)

RNasin

T4RNA 连接酶

3. 核酸和寡核苷酸

RNA 寡核苷酸,由上面第 3 阶段制备

TAP 处理过和没有处理过的 RNA 样品

4. 特殊设备

Microcon100 过滤器

预设为 17°C 的水浴或加热仪

5. 其他

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备,包括溴化乙锭

二、方法

1. 取两个无菌的离心管,一个加 TAP 处理过的细胞 RNA,另一个加没处理过的细胞 RNA。

连接缓冲液(10X)                              3ul

RNasin(40U/ul)                                   0.75ul

RNA 寡核苷酸                                      4ug*

TAP 处理(或非处理)的 RNA            10ug

ATP(2 mmol/L)                                     1.5ul

T4RNA 连接酶(20U/ul)                       1.5ul

H2O                                                       至 30ul

*比目的细胞 RNA 多 3~6mol

2.17°C 过夜反应 16 h。

3. 用 Microcon100 过滤器纯化连接产物(用水洗 3 遍,过滤器预先用无 RNA 酶的水冲洗),回收体积不应超过 20ul。

4. 取 1/3 体积的连接产物,进行 1%TAE 琼脂糖凝肢电泳,以检查连接 RNA 的完整性。它应该没有多大变化。

第 5 阶段:反转录

一、材料


1. 缓冲液、溶液和试剂

dNTP 溶液(含 4 种 dNTP,各 10 mmol/L)

DTT,0.1mol/L

TE(10mmol/LTris-HCl,pH7.5,lmmol/LEDTA,pH8.0)

2. 酶和酶缓冲液

反转录缓冲液 5X(由制造商提供)

RNA 酶 H

RNasin

SuperscriptII 逆转录酶(Invitrogen)

3. 核酸和寡核苷酸

反义特异性引物(20ng/ul),或六碱基随机引物(50ng/ul)

连接寡核苷酸的 RNA,由上面第 4 阶段制备

4. 特殊设备

预设为 37°C、42°C、50°C、70°C 的水浴或加热仪

二、方法

1. 在一个无菌离心管中,于冰浴上混合以下转录组分。

反转录缓冲液,5X               4ul

dNTP 溶液(10 mmol/L)      1ul

DTT(0.lmol/L)                       2ul

RNasin(40U/ul)                     0.25ul

2. 在另一个管中,将剩余的 RNA(约 6.7ug) 溶于 13ul 水中,加入 20ng 的反义特异性引物或 50ng 的六碱基随机引物,80°C 温育 3 min, 迅速在冰上冷却,在离心机中离心 5s。

3. 将 RNA/引物混合物加入到反转录组分中,然后加 1ul(200U) 的 SuperscriptII 逆转录酶,42°C 温育 lh, 然后 50°C 温育10min。如果用的是随机引物,在混合了各组分之后,加一步室温温育 10min 的反应。

4.70°C 温育 15 min,使逆转录酶失活,再离心 5s。

5. 加入 0.75ul(1.5U) 的 RNA 酶 H,37°C 温育 20 min, 以破坏 RNA 模板。

6. 用 TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,lmmol/LEDTA) 将反应混合物稀释至100ul,4°C 保存(这就是 5'末端寡核苷酸-cDNA 文库)。

第 6 阶段:扩增

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,lmmol/LEDTA、pH8.0)

DMSO

2. 酶和酶缓冲液

dNTP 溶液(含 4 种 dNTP, 各 10mmol/L)

Taq 聚合酶(原文缺。—译者加)

Taq 聚合酶缓冲液(10X)

3. 核酸和寡核苷酸

5'末端寡核苷酸-cDNA 文库(由第 5 阶段第 6 步得到)

寡核苷酸引物 GSP1、GSP2、NRC1 和 NRC2(NRC1 和 NRC2 引物的细节见图 25-4)

4. 特殊设备

可设程序的热循环仪

二、方法

1. 第一轮

(1) 在一个无菌的 0.2 ml 离心管中混合以下组分。

Taq 聚合酶缓冲液(10X)                 5ul

dNTP 溶液(10 mmol/L)                  1.0ul

DMSO                                               5ul

Tag 聚合酶                                        2.5U(原文缺。-—译者加)

H20                                                   加至 50ul

(2) 取 5'末端寡核苷酸-cDNA 文库 1ul,加入 GSP1 和 NRC1 引物各 25pmol。

(3) 在 DNA 热循环仪上 98°C 加热 5 min, 使第一链产物变性,并激活聚合酶。冷却至合适的温度(56?68°C) 退火 2 min,72°C 延伸 40 min。

(4) 按下列程序进行 30 个(原文为 35 个。一译者改)扩增循环。



2. 第二轮

(5) 取第一轮的部分扩增产物,用 TE 以 1:20 稀释。

(6) 用上面介绍的程序,但省略掉 2 min 的退火和 72°C40 min 的延伸步骤, 用 GSP2 和NRC2 引物扩增 1ul 稀释样品。

© 版权声明
THE END
喜欢就支持一下吧
点赞5 分享
评论 抢沙发
头像
请输入有效评论哦,肆意灌水或者乱打评论是不会通过的,会影响您评论后获得资源哦~~
提交
头像

昵称

取消
昵称表情

    暂无评论内容