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简介

当今，PCR 技术已成为分子生物学领域一种有力的研究工具，应用于现代分子生物学各个方面。人们发明各种各样 PCR 方法来克隆基因，因而在基因克隆和载体构建上，PCR 技术得到广泛的应用，并业已成为传统重组基因技术的一种必要的补充手段。常规的克隆和重组 DNA 技术需要用限制酶对 DNA 片段进行消化和用连接酶将两个片段连接起来。但有时待克隆的基因没有合适的限制酶切位点，不能用常规的重组 DNA 技术将其克隆。为克服该困难，人们就设法应用不需要连接反应的 PCR 克隆方法，于是不依赖连接反应的克隆 PCR (ligation-independent clo¬ning PCR, LIC-PCR) 就应运而生。人们发明了两种不同的不需要连接反应的 PCR 克隆方法，这些方法都在扩增的 DNA 片段的两端产生大约 10〜12 个碱基的单链末端，它们能够同载体的互补序列发生特异性的退火，然后就可以转化感受态细菌，而不必进行连接反应。一种由 Aslanidis 和 deJongW 发明，他们在设计 PCR 引物时，使引物未端 12 个或更多的碱基中只有三种核昔酸•然后对获得的 PCR 产物用 T4 DNA 聚合酶进行消化，并且在消化液中掺入了在产物 3』端没有出现过的核昔酸。另一种能使 PCR 产物两端产生突出末端的方法就是利用尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG)。

原理

不依赖连接反应的克隆 PCR 实验的基本原理是利用尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG)。UDG 酶是参与 TTP 生物合成的一种酶，它能水解脱氧核糖基团与尿嘧啶之间的 N-糖昔键。这种酶解反应产生脱碱基的 dU 残基，从而破坏 DNA 的碱基配对。此法就是在引物的 5』端加上掺入脱氧尿嘧啶的尾巴，并用 UDG 选择性地去掉 PCR 产物 5』端的突出脱氧尿嘧啶。这些产物就可以同含有互补序列的合适载体退火，从而使载体和插入的外源片段形成环状。这种重组质粒就可以有效地转化入大肠杆菌中 (图 10-15) 。这种方法重要的就是要使产物的 3』突出端含有足够数目的核昔酸残基，从而能够使载体插入的 PCR 产生的 DNA 片段发生稳定有效的退火反应。另外，在引物设计时，将 dUMP 安插在 PCR 模板与载体互补序列的连接处，以及在寡核昔酸引物的 5'端添加入几个 dUMP 残基也很重要，经 UDG 酶切后，使寡核昔酸中其它碱基失去与互补链的相互作用，从而产生岀单链的突出端。

应用

不依赖连接反应的克隆 PCR 实验的常用应用领域如下： 1. 利用 PCR 和 UDG 克隆进行位点特异性突变在 PCR 过程中利用含脱氧尿嚅嚏寡核昔酸作引物是使 3』端产生悬突的便利方法⑸。以质粒点突变为例，首先合成含有目的核昔酸突变的两个重叠引物，其所有 5'端胸腺嚼陰残基均被脱氧尿啥嚏所取代。PCR 产物 5'端对 UDG 很敏感，利用 UDG 对 PCR 产物处理后，dU 残基被切掉，产生了 3'黏末端，经退火后环化，转化大肠杆菌后经体内修复，产生新的质粒分子，该新生质粒分子除想要的突变外，与野生型的母代质粒相一致。有时候，感兴趣的基因并不是质粒，或者质粒太大不能完整扩增。那么就可对该基因分两次扩增, 再利用 UDG 进行克隆。在这一过程中，设计两个突变引物，这两个突变引物含有 dU, 并且能够重叠，每个突变引物再分别与合适的 5』或 3'引物进行独立的 PCR, 它们都包含 dU 序列，以使 UDG 能克隆进合适的载体。获得的扩增产物在一个试管内与载体和 UDG 混合，能产生含有目的突变的嵌合分子，获得的环形嵌合质粒直接用于感受态大肠杆菌细胞的转化，携带嵌合质粒的克隆则含有目的突变。 2. 产生新基因 Rashtchian 等⑹利用 LIC-PCR 克隆编码人的 Ciliary 神经增殖因子（CNTF）基因，因为 CNTF 由一个内含子及它所隔开的两个外显子组成，需要用 PCR 方法把它们从基因组中克隆出来。在 PCR 引物设计时，用脱氧尿嗟喧代替胸腺嚏呢，就能够产生 3』单链（如图 10-16 所示）。这样两个外显子组装成 CNTF 的全长序列，对组装成的序列进行测序分析，完全同野生型 cDNA 序列一致。并且用同样的方法克隆了神经生长因子前体序列。

用 PCR 的方法从基因组 DNA 中扩增出基因的外显子序列，经拼接而组装成基因的全序列在分子生物学中有着无数的先例。这样可以依照研究需要进行任意拼接进而研究各部分的功能，特别是如果 cDNA 或者 RNA 很难获得时，这种方法便可大显其手。RACE 技术已成功地应用于当 mRNA 很少时来获得 cDNA。UDG 克隆技术在 3『RACE 和 5『RACE〔E 已成功应用。其它的应用包括如嵌合毒素、嵌合抗体、蛋白结构域改变和其它的突变设计。 PCR 技术现在应用于多样的抗体家族。这可能主要因为抗体的可变区和恒定区在 5』和 3』端都具有保守的序列。直接扩增抗体的保守序列就可以构建含有大量不同的轻链和重链的抗体 cD- NA 文库。在这个文库中，一个载体就可以表达每个抗体的不同片段。当然这些技术只能在一些实验室中应用。UDG 在抗体工程中的应用还有人源化抗体等。 3. 未来应用 PCR 技术已在分子生物学领域中广泛应用，随着新的 PCR 技术不断出现，它的应用将更加广泛。近来用 PCR 技术在扩增 DNA 片段方面取得了重大进步。Barnes⑴把 DNA 聚合酶和一种具有 3』外切酶活性的 DNA 聚合酶混合到一起，成功地扩增出 35 kb 的长片段 DNAO 因为长片段 DNA 可能包含很多的限制酶切位点，因此用限制酶克隆的方法可能不很实用。因为用具有 3'端外切酶活性的聚合酶，在长片段 PCR 中要把 3'端的悬突去掉，生成平端，所以 TA 的克隆方法也不实用。在这种情况下，不需要连接反应的 PCR 克隆方法因为不需要限制酶消化和去掉 3』端额外的核昔酸就显得特别适用。不需要连接反应的 PCR 应用于基因合成方面，具有重叠片段的寡核昔酸能够通过不需要连接反应的 PCR 退火连接到一起。虽然大部分研究者在不断寻找高忠实性的方法来克隆基因，当然高忠实性的 PCR 是有用的。但 Cadwell 和 JoyceW 充分利用低忠实性的 PCR 反应来产生一系列的突变体，Arnold 也用这种方法来产生突变的蛋白。这种方法产生的随机突变用于筛选能够提高催化活性的突变子。它同 DNA 改组 (shuffling) 方法结合可用来快速研究蛋白质的体内进化，从而发现蛋白质的一些新活性口七当然这些方法要成功就必须有效的克隆大量不同基因并能够有效的筛选。不需要连接反应的 PCR 克隆方法具有的高效连接效率和在 DNA 文库方面的简便应用将使它在这些方面得以发展. 由此证明，利用 UDG 克隆一系列的基因 DNA 片段是一种极为有效的方法。另外，此项技术也是 DNA 序列在任一点连接 DNA 片段常用的方法，而不须利用限制性酶切位点。它的这个特点可以快速地发现新基因和 DNA 结构，使分子生物学家和蛋白质工程学家有更多的选择。

操作方法

不依赖连接反应的克隆 PCR 实验

简介

原理

材料与仪器

器材：

PCR 仪、电泳仪。

试剂：

①待扩增基因的上游引物 P1（5』端为 CUACUACUACUA）和下游引物 P2（5『端为 CAU- CAUCAUCAU）。

②模板（mRNA 或 cDNA）

③热稳定聚合酶及 10X 缓冲液

④10 mmol/L dNTP

⑤pAMPl 载体（25 ng/μL）

⑥退火缓冲液

⑦尿嘧啶 DNA 糖基化酶（1U/μL）

步骤

不依赖连接反应的克隆 PCR 实验的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

A 用于 LIC-PCR 的上游引物 R 的 5』端为 CUACUACUACUA, 再加上待扩增基因的互补序列；下游引物 P2 的 5』端为 CAUCAUCAUCAU, 再加上待扩增基因互补序列。

（二）PCR 反应

A 按照标准 PCR 反应体系，加入所需试剂，进行标准的 PCR 反应。

（三）退火反应

A 在 0.5 mL 离心管中加入以下试剂（置于冰上）

B 混合均匀，37 °C 温育 30 min 后置于冰上。

（四）转化

A 取退火反应液 1〜5 叫转化 DH5a 感受态细菌。

注意事项

1 CLONEAMP 试剂盒提供一 44 bp 的阳性对照 DNA, 退火反应时加入叩 1（约 25ng）到反应体系中。

2 重组子的多样性直接同 PCR 产物的多样性相关，也就是说若 PCR 产物中包括很多种扩增片段，那就有可能每一种 PCR 产物的末端含有脱氧尿嚅嚏的引物特异连接片段。这也是一种建立 PCR 文库的理想方法，人们也就可以根据自己所需筛选理想克隆。

3 一些扩增反应可能会产生引物二聚体等非目的产物，这就需要重新设计引物，可以用 dTMP 来代替 dUMP, 这样就不会产生由 dU 引起的引物二聚体问题。

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THE END

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