简介
菌落PCR可用于：（1）重组体的筛选；（2）重组体DNA测序分析。
操作方法
菌落PCR
原理
直接挑取菌落进行PCR，PCR的95℃加热可以破胞，释放基因组DNA或质粒，成为PCR体系的模板，然后进行链式扩增。
材料与仪器
菌落样品dNTP PCR混合液
PCR仪
步骤
1. PCR混合液的制备（1）Taq buffer（10x） 180 ul
（2）dNTP（2.5 mM） 20~25 ul
（3）Primer Forward（引物浓度在10 Pmol） 5 ul
（4）Primer Reverse（引物浓度在10 Pmol） 5 ul
（5）ddH2O 147 ul
（6）Taq（2 U/ul） 12~15 ul
2. 常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落（强调单个，不能是双克隆），在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝。
3. 然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR管中或者96空pcr反应板（管子做好记号，如平板上点的是1#，则管子上也标1#，以便筛选到克隆后的扩到培养）。
4. 挑好单克隆菌落后将之前配制好的PCR混合液加入体系是30 ul。
5. 将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。
6. 将扩增出来的反应液中加入溴酚蓝或是其他染料，电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。
7. 将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增。
8. 次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。
注意事项
1. 设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。2. 使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题，有的GC含量很低，有的又很高，导致菌落PCR不容易扩增出目的条带，在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限，每一循环降0.2度左右。
以质粒为模板的 PCR 实验流程
审核专家 | 赵玉洁博士
生理学 厦门大学
原理
聚合酶链式反应热变性温度下成熟质粒可以解螺旋、解聚，暴露的单链核苷酸序列可以作为模板，在特异引物、脱氧核糖核酸酶、DNA 聚合酶等存在的情况下扩增出大量目的序列。
用途
扩增出大量特异的目的 DNA 分子
材料与仪器
仪器：PCR 热循环仪 琼脂糖凝胶电泳系统 凝胶成像仪或紫外透射仪
材料：成熟质粒 dNTP 引物对 耐热 DNA 聚合酶 PCR 管 琼脂糖 EB
试剂：10×PCR Buffer(含 Mg2+) TAE 10×loarding-buffer
步骤
1.在 0.2ml PCR 管中配制 25 μL 反应体系
2.5mmol/L dNTP 混合物 2μL
10×PCR buffer 2.5μL
正向引物（10μmol/mL） 1μL
反向引物（10μmol/mL） 1μL
稀释后的成熟质粒模板（0.01μg/μL） 1μL
DNA 聚合酶 1U(Y μL)
高压灭菌 ddH2O 补齐至25μL
2.按以下程序在 PCR 仪内进行扩增
① 94℃ 预变性 5min
② 94℃ 变性 1min
③ 55℃ 退火 1min
④ 72℃ 延伸 2min
⑤ 重复步骤 ②→④ 25-35次
⑥ 72℃ 延伸 10min
3.用 1×TAE 溶液配制 0.8-1% 琼脂糖凝胶，25μL PCR 扩增产物补加 3μL 10×Loarding buffer和2μL 高压灭菌 ddH2O，恒压 80-120V 跑琼脂糖凝胶。
4.凝胶成像仪器或紫外透射仪下观察电泳结果。
注意事项
1.成熟质粒测量好浓度后用高压灭菌 ddH2O 稀释至 0.01μg/μL，充分混匀;
2.PCR 系统中的酶加入量为 1 个单位，注意购入酶的单位；
3.干粉引物拿到后低速离心后用高压灭菌 ddH2O 稀释10μmol/mL，充分混匀;
4.退火温度根据引物序列按公式 Tm＝2×（A+T）+4×（C+G）确定;
5.聚合酶链式反应循环中的延伸时间需根据序列长度和聚合酶效率确定。
常见问题
1.PCR 产物的准确性
为确保序列准确性，DNA 序列需测序。
2.PCR 后无阳性条带
注意体系中酶的加入量是否过多；退火温度是否合适；循环中的延伸时间设计是否得当；是否漏加模板、引物或聚合酶。
以 cDNA 为模板的 PCR 实验流程
审核专家 | 赵玉洁博士
生理学 厦门大学
原理
以 mRNA 为模板，在反转录酶的催化下形成的互补DNA(complementary DNA)即为 cDNA，由于 cDNA 不像基因组DNA 那样有内含子，可以在原核生物中表达，基因蛋白编码序列的扩增、重组载体构建等常以 cDNA 为模板进行聚合酶链式反应。
用途
获取不含内含子的 DNA 序列，用于可在原核生物中表达、扩增载体的构建。
材料与仪器
仪器：PCR 热循环仪 琼脂糖凝胶电泳系统 凝胶成像仪或紫外透射仪
材料：cDNA 模板 dNTP 引物对 耐热 DNA 聚合酶 PCR 管 琼脂糖 EB
试剂：10×PCR Buffer(含 Mg2+) TAE 10×loarding-buffer
步骤
1.在 0.2ml PCR 管中配制 25 μL反应体系
2.5mmol/L dNTP 混合物 2μL
10×PCR buffer 2.5μL
正向引物（10μmol/mL） 1μL
反向引物（10μmol/mL） 1μL
cDNA 模板 10-100ng(X μL)
DNA 聚合酶 1U(Y μL)
高压灭菌 ddH2O 补齐至 25 μL
2.按以下程序在PCR仪内进行扩增
① 94℃ 预变性 5min
② 94℃ 变性 1min
③ 55℃ 退火 1min
④ 72℃ 延伸 2min
⑤ 重复步骤 ②→④ 25-35次
⑥ 72℃ 延伸 10min
3.用 1×TAE 溶液配制 0.8-1% 琼脂糖凝胶，25μL PCR 扩增产物补加 3μL 10×Loarding buffer 和 2μL 高压灭菌 ddH2O，恒压80-120V 跑琼脂糖凝胶。
4.凝胶成像仪器或紫外透射仪下观察电泳结果。
注意事项
1.PCR 系统中的酶加入量为 1 个单位，注意购入酶的单位;
2.干粉引物拿到后低速离心后用高压灭菌 ddH2O 稀释 10 μmol/mL;
3.退火温度根据引物序列按公式 Tm＝2×（A+T）+4×（C+G）确定;
4. 聚合酶链式反应循环中的延伸时间需根据序列长度和聚合酶效率确定。
常见问题
1.PCR 产物的准确性
为确保序列准确性，DNA 序列需测序。
2.PCR 后无阳性条带
注意体系中酶的加入量是否过多；退火温度是否合适；循环中的延伸时间设计是否得当；是否漏加模板、引物或聚合酶。
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