反向 PCR (inverse-PCR)

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简介

利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析,探索邻接已知DNA片段的序列,并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆,建立全长的DNA探针。可用于:(1)基因游走研究;(2)转位因子研究;(3)已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。

操作方法

反向 PCR(iPCR inverse PCR )

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合作专家 | 周康硕士

分子生物学 安徽农业大学

原理

标准 PCR 用来扩增位于两条引物内侧的 DNA 片段,与此相反,反向 PCR 技术(也被称为倒置或者向外 PCR)是用于扩增一段已知 DNA 序列旁侧的 DNA 序列,这些序列中没有可以用于扩增的引物。

在快速高效的 DNA 测序出现之前,这项技术在几个独立课题组内都得到很好的发展前,在多数情况下,测序已成为确定未知 DNA 片段的主要选择手段。然而,反向 PCR 仍旧被广泛应用于快速的等位基因分型,以及确定整合到基因组中的反转录病毒、转基因、转座子的定位。反向 PCR 要用到一种限制性内切核酸酶对大分子 DNA 酶切消化,制备一个包含已知序列及其侧翼区域的 DNA 片段。

个别限制性酶切片段(哺乳动物的基因组 DNA 可能产生成千上万条片段)通过自身分子环化连接,然后这种包含已知序列的环化 DNA 可以被用来作为 PCR 模板。未知序列通过与已知序列特异结合的引物反方向扩增获得。

材料与仪器

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶

含 MgClz 的扩增缓冲液(与耐热 DNA 聚合酶一起提供)(10x) ATP(10mmol/L)

噬菌体 T4 连接酶(1U/uL)氯仿

含有所有 4 种dNTP(pH80)的 dNTP 溶液(20mmol/L)乙醇

溴化乙锭( EB )或者 SYBRGold

连接酶缓冲液(10x)(和 T4 连接酶一起提供)

溶于水的正向引物( 20umol/L)和反向引物( 20umol/L),除了在模板分子上的位置不同之外,反向 PCR 引物并没有其他特别之处,因此提供的是一般引物。


设计的规则:每个引物应该长 20~30 个核苷酸,并且其中 4 种碱基的数量大约相等,G 和 C 的分布要均衡,形成稳定二级结构的倾向低。限制性内切核酸酶酶切位点可以添加到引物 5 端,以便扩增产物的克隆和操作。

酚:氯仿 ( 1∶1,V/V)限制性内切核酸酶乙酸钠( 3mol/L) TE 缓冲液( pH8.0 )

10mmol/LTris-Cl(pH8.0)1mmoI/LEDTA

用含少于 0.1mmol/LEDTA 的 10mmol/LTris-Cl(pH7.6) 溶解的模板 DNA

反向 PCR 需要一个环状的 DNA 作为模板,此方案中,步骤 1~4 描述的是如何将传统方法制备的线性 DNA 转反为环形 DNA,这些线性 DNA 可为纯化的 DNA 片段,也可为总基因组 DNA,或其一定大小的组分;λ噬菌体 cDNA 文库;一份黏性质粒或噬菌体 P1 基因组文库;或 ~10°bp 以下的 DNA 序列。线性 DNA 的使用量至少在 lug 以上以便环化,并在几个浓度下进行 PCR。

耐热 DNA 聚合酶

Tris-Cl(10mmol/L,pH7.6)自动微量移液器使用的带滤芯的吸头

微量离心管(0.5mL,壁薄以利于扩增反应)或微孔板正排量移液管

可编程所需扩增程序的热循环仪,如果没有配备热盖,那么在 PCR 循环中可以用矿物油或石蜡来防止反应混合液中液体的蒸发。

16℃ 的水浴。

步骤

1.基于已知 DNA 序列,设计并合成寡聚核苷酸引物 1 和引物 2。

 

2.用合适的限制性内切核酸酶(见以下注释)消化 2~5ugDNA 模板(序列 <10bp)。用酚:氯仿提取消化后的 DNA,再用氯仿单独抽提。加 01 倍体积的 3mol/L 乙酸钠和2.5 倍体积的乙醇使 DNA 沉淀,离心回收沉淀,用 TE 缓冲液(pH80)溶解使浓度为100mg/mL。

(选做步骤,DNA 消化后置 65℃ 加热 15~20min 使酶失活。用 Southern 印迹杂交实验来选择可以把片段切成适当大小(1~4kb)的限制性内切核酸酶。为提高模板 DNA 连接时自身环化效率,尽量选择能够产生黏性末端的酶。若只能选择平端酶,则需要在连接缓冲液中加入聚乙二醇。)

 

3.在 0.5mL 的无菌微量离心管、PCR 管或灭菌的微孔板中,设定一系列连接反应,其中切割模板 DNA 的浓度范围为 0.1~1mg/mL。
模板 DNA    10~100ng    
连接缓冲液(10x)    10μL    
噬菌体 T4DNA 连接酶(1U/uL)    4μL    
三磷酸腺苷(10mmol/L)    10μL    
水加至 100uL    
反应体系置 16℃ 孵育 12~16h
某些商品化的连接缓冲液包含 ATP。若使用此类缓冲液,不需要在连接体系中额外添加 ATP。
理论上,利于连接过程中形成单分子环的条件很好找(Collinsand Weissman1984),但在实际中很难做到。为避免分子间的串联,更好地形成分子内环化,DNA 末端的摩尔浓度必须降低。然而,在大小不同的 DNA 分子的分布,以及末端被损坏的分子比例未知的情况下,很难推算出合适的 DNA 浓度,最好的办法就是用浓度范围为 1~10μg/mL 的 DNA 进行一系列连接反应,然后把这一系列连接反应的产物用于以下步骤。

 

4.连接 DNA 用酚:氯仿提取后,再用氯仿单独抽提。加 01 倍体积的 3mol/L 乙酸钠和 2.5 倍体积的乙醇使 DNA 沉淀,离心回收沉淀并重溶于 10mmol/LTris-Cl(pH7.6)或水中,浓度为 100μg/mL。

 

5.在灭菌的 0.5mL 薄壁扩增管中加入下列试剂并混匀:
扩增缓冲液(10x)    5μL    
4 种 dNTP 溶液(pH8.0),每种浓度在 20mmol/L    1μL    
寡核苷酸引物 1 (20umol/L)    2.5μL    
寡核苷酸引物 2 (20umol/L)    2.5μL    
耐热 DNA 聚合酶(1~5U/uL)    1.0μL    
水    28~33μL    
连接后的模板 DNA    5~10μL    
总体积   至 50μL

 

彬线性 DNA 模板有时比环状 DNA 更有益于反向 PCR 的扩增效率。我们可以在两条引物 5 端之间的已知序列区域寻找一个限制性藤切位点,把环化的 DNA 分子线性化。最好这个蘸不能对未知序列讲行切割。或者在制备扩增反应体系之前,将模板加热至 100℃、15min,也可以使环状分子线性化,不过效率比较低(Triglia et al.1988;Ochmar et al. 1993)。


设置两个对照反应。其中一个反应包含除 DNA 模板以外的上述所有试剂。另一
个反应中,用一个携带已知片段大小的质粒取代 DNA 模板,此质粒包含用于设计寡核苷酸引物的 DNA 片段。
第一个对照确保任何可见产物都与外源 DNA 无关。第二个反应测试 PCR 各试剂的保真性。


6.如果热循环仪没有配备热盖,可在反应混合物中加一滴(约50uL)轻质矿物油。这样可以避免样品在重复冷热循环中蒸发。另外,在使用热启动 PCR 时可在管中加一粒石蜡。将反应管或微孔板放入热循环仪。利用下表列出的变性、复性和延伸时间及温度扩增核苷酸:
循环数变性复性延伸
30 个循环    94℃,30s    55℃,30s    72℃,2.5min    
末循环 94℃,30s55℃,30s72℃,10min
这些时间适用于配制在 0.5mL 薄壁管中,在诸如 PerkinElmer9600 或9700Mastercycler(Eppendorf公司)和PTC-100(MJResearch公司)等 PCR 仪上孵育的 50uL 反应体系。时间和温度可以根据设备类型及反应体积做适当调整。
许多热循环仪的结束程序是扩增样品保持在 4℃ 直至被取出。样品可以在此温度下放置过夜,但随后需放在 -20℃ 保存。
在一个特定的 PCR 反应中,引物对的具体复性温度得靠经验估计。若靶 DNA 较长(大于 4kb),应当尝试延长
延伸时间(每个循环延长到 10min)。另外,使用突变的、缺乏外切核酸酶活性的耐热DNA聚合酶可以获得较长的扩增片段。

 

7.从反应体系以及对照组体系中取出 5~10uL 样品,通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。使用合适的 DNAmarker。用溴化乙锭或 SYBRGold 进行凝胶染色。
成功的扩增反应应该产生一条清晰可见的 DNA 条带,条带可以通过 DNA 测序、限制性酶切图谱分析,或者使用与已知 DNA 序列同源的探针进行 Southern 杂交来进一步鉴定。

 

注意事项

1. 需要从许多酶中选择合适限制酶,或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的 DNA 片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶 DNA。

 

2. 基因组 DNA 必须酶切完全。

 

3. 为提高分子间连接的效率,连接反应中 DNA 的浓度要低,因为高浓度的 DNA 可能会提高非同源连接水平,从而产生非特异性扩增。

 

4. 成环的 cDNA 进行裂解和变性比较重要,因为环状双链 DNA 分子易于形成超螺旋而不利于 PCR 反应,它只可以扩增出较短的 DNA 片段。

 

5. 碱变性法已成功地用于制备 PCR 和测序 DNA,该方法也可以有效地使环化的双链 cDNA 实现变性。

常见问题

1.没有扩展条带酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA 聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

2.模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成 DNA 脱嘌呤而影响PCR的结果。

3.变性温度是否准确: PCR 仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在未加Tag酶以前,将反应体系95℃ 加热5~10分钟。

4.引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。

5.引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。DNA 凝胶电泳时加入阳性对照,确保不是DNA凝胶和PCR 程序的问题。2PCR产物量过少退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR 反应优化退火温度。DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。

6.PCR 循环数不足。增加反应循环数。

7.引物量不足。增加体系中引物含量。 

8.扩增产物跑电泳条带弥散

(1)退火温度不合适。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。

(2)DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。

(3)PCR 循环数不足。增加反应循环数。

(4)引物量不足。增加体系中引物含量。

(5)延伸时间太短。以 1kb/ 分钟的原则设置延伸时间。

(6)变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。

(7)DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净

9.扩展产物出现杂带

(1)酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。

(2)dNTP 浓度过高。减少 dNTP 的浓度。

(3)MgCl2 浓度过高。可适当降低其用量。

(4)模板量过多。质粒 DNA 的用量应 <50ng,而基因组 DNA 则应<200ng。

(5)引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。

(6)循环次数过多;增加模板量减少循环次数至 30,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的 PCR 循环。

(7)退火温度过低。

(8)电泳体系有问题:

①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大;

②凝胶没有凝固好;

③琼脂糖质量差。

 10.条带大小与理论不符

(1)引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

(2)循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。

(3)酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。

(4)退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

(5)样品处理不当。

(6)Mg2+ 浓度偏高,因适当调整 Mg2+ 使用浓度。

(7)若为 PCR 试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。

(8)复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

(9)反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

(10)引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。

(11)引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

(12)模板量过多。质粒 DNA 的用量应 <50ng,而基因组 DNA 则应 <200ng。

(13)外源 DNA 污染。确保操作的洁净。

 

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