简介
单细胞PCR利用流式细胞技术可以分 离出某个特定类型的细胞。利用单个细胞可以在DNA 或mRNA水平上进行PCR分析，从而找到单个细胞内 的分子改变情况。
目前，应用于单细胞PCR的方法主要有1种：单细胞PCR。
原理
单细胞PCR基本原理是单个细胞中往往含有极少的（少至一个拷贝）目的DNA或RNA,因此，从单个细胞中扩增DNA或 RNA序列需要特定的条件。首先要分离出单个特定细 胞，这可以利用显微操作（适合于细胞形态特征明显 的细胞）或流式细胞技术来实现。
分离出单个细胞后, 将细胞裂解，释放出目的DNA或RNA。若分析DNA, 以裂解细胞而不破坏细胞核为宜，然后以裂解产物为模板进行PCR反应。若分析RNA,要先将 RNA反转录成cDNA,然后进行PCR反应。
PCR产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳，或进一步做点杂交或Southern blot进行分析。
应用
单细胞PCR常用应用领域如下：
1. 单细胞PCR用于单精子的分型
利用单细胞PCR分析单个精子中连锁遗传标记的等位基因岀现的频率，可以计算出相邻基 因标记之间的重组频率，从而推算出连锁遗传标记之间距离，为构建哺乳动物基因组的遗传图谱 提供了一个有力的方法。尤其对那些不能大量繁殖或世代周期格外长的生物，制作这些物种的 遗传图谱，单精子分型显得更为有效。
2. 单细胞PCR运用于淋巴结造血系统疾病的研究
如霍奇金病中里德-斯特恩伯格细胞（RS细胞）的起源研究。由于霍奇金病侵犯的淋 巴结中，肿瘤性成分里德-斯特恩细胞常少于1% ,因而从组织中抽提的DNA实际上是肿瘤 细胞DNA和其它细胞DNA的混合物，故这种抽提方法在检测RS细胞上是不适用的。
免疫 组化和原位杂交相结合，可以对单个霍奇金细胞和RS细胞进行基因表达的检测，但不能对 其DNA进行更详细的研究。单个细胞PCR技术弥补了上述不足。
Kuppers等从一例患硬化 型霍奇金病的患者中分离出RS细胞，利用单细胞PCR获得了 12个IgH基因重排产物，对 其中8个产物进行的测序分析显示，7个细胞具有完全一致的序列，提示该例患硬化型霍奇 金病的患者中的RS细胞至少有一部分来源于克隆性B细胞。在组织切片上进行单个细胞 分离及PCR,就方法学而言完全具有可行性，对淋巴造血系统病变的研究也是非常适宜的。
单细胞研究还可被运用于淋巴结生发中心及其它类型恶性淋巴瘤的研究，因为只有通过单细 胞研究，才能获得有关克隆相关性、克隆内差异和延续突变的信息。该方法加以改进还可用 于其它各种肿瘤，尤其可用于对肿瘤细胞之间混有大量非肿瘤细胞的样品进行癌基因和抑癌 基因的分析，以及肿瘤细胞的克隆性研究。
操作方法
单细胞PCR
简介
单细胞PCR技术是从生命的基本单位--细胞水平上进行DNA或RNA分析的PCR方法。
原理
单细胞PCR的基本原理是分离出单个细胞后, 将细胞裂解，释放出目的DNA或RNA。若分析DNA, 以裂解细胞而不破坏细胞核为宜，然后以裂解产物为模板进行PCR反应。若分析RNA,要先将 RNA反转录成cDNA,然后进行PCR反应。
材料与仪器
器材：流式细胞仪、PCR仪、离心机、电泳仪
试剂：
1.单细胞分离的试剂：
台盼蓝、PBS、单克隆抗体、胶体金、10%二甲基亚砜(DMSO)、0.9% 的NaCl溶液、0.5% 胰酶、0.04 mg/ml DNA酶、0.16% 羟丙基甲基纤维素(HPMC)、碱性磷酸酶-快红、苏木精
2.单细胞PCR试剂：
A. 1×PCR反应缓冲液(50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl pH8.3, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mg/ml明胶)
B. 0.05 mg/ml蛋白酶K
C. 20 mmol/L DTT
D. 1.7 μmol/L SDS
E. PCR引物
F. dNTP
G. Taq DNA聚合酶
3.单细胞PCR产物分析试剂：
A. SSC缓冲液
B. 50% 去离子甲酰胺
C. 5×Denhardt 液
D. 鲑鱼精DNA
E. SDS
F. 0. 1% Na2H2P2O7
G. SET缓冲液
步骤
单细胞PCR的基本过程可分为如下几步：
（一）单细胞的分离
1.单个淋巴细胞的分离
用相同体积的RPMI1640培养基在50 ml离心管中稀释10 ml血液，再在上层覆盖20 ml已放置到室温的Ficoll-Paque Plus,室温500 g离心20 min，小心吸出中间暗黄色的液层，放于50 ml的离心管中。用40 ml PBS重悬细胞，500 g 离心15 min,弃上清，用10 ml PBS重悬细胞。
取10 μl细胞悬液，加人15 μl PBS和25 μl台盼蓝，进行细胞计数。将细胞悬液300 g离心5 min后，重悬于PBS中至细胞浓度为2×107个/ml。
取50 μl细胞悬液于5 ml的离心管中，加入20 μl未稀释的单克隆抗体(如抗CD19的单克隆抗体)，4℃避光放置30 min。用 4ml PBS洗细胞两次，每次120 g离心5 min。用0.5 ml PBS重悬细胞，用流式细胞仪分选细胞。 -80 ℃保存。
2.从新鲜组织中分离单个细胞
以大鼠视网膜神经节细胞为例进行说明。
(1)视网膜神经节细胞的逆行标记：试验用的动物在进行手术解剖前，首先腹腔注射Rompun和Ketalar的混合剂，注射的剂量分别为: 10-15 mg/kg及30-100 mg/kg体重。视网膜神经节细胞从上丘用荧光示踪物——胶体金进行逆行标记。
当暴露后，将一块吸收了3% 的胶体金和10% 二甲基亚砜(DMSO)的0.9% 的NaCl溶液的明胶海绵覆盖上丘表面。这样细胞末端将暴露于胶体金，并逆行转移至视网膜中的神经细胞体。最优化的标记效果是加人胶体金后作用7d。
动物腹腔注射3~4 ml苯巴比妥处死。眼周的颞-鼻边缘用缝线标记，摘下眼球迅速置于冰上准备解剖。
(2)机械分层法分离视网膜神经节细胞：在无菌的PBS缓冲液中分离出眼球，小心地将视网膜从巩膜上分离并分成四份。用镊子将一片视网膜放置在硝酸纤维素膜(5 mm×5 mm)上，将感光器朝向硝酸纤维素膜。
去除玻璃体，将硝酸纤维素膜和视网膜放在含有0.5% 胰酶和0.04 mg/ml DNA酶的PBS中于37 ℃作用15 min。将硝酸纤维素膜放在Millipore的滤纸上5 s,吸去多余的液体，然后内层视网膜朝下放在未经包被的盖玻片(24 mmX 60 mm)上。
将一片稍小的盖玻片(24 mm×32 mm)放在Millipore的滤纸上以促进黏附在玻璃表面，构成“三明治”样的结构，置于37 ℃放置5 min。将小盖玻片去掉，用镊子小心地掀起滤纸和视网膜即可得到分离的薄层。分离到的细胞立即放入含有0.16% 羟丙基甲基纤维素(HPMC) 的PBS中以增大黏度稳定细胞。
(3)单个视网膜神经节细胞的收集：细胞保存在最初的盖玻片上，在倒置荧光显微镜下挑取细胞。单个的视网膜神经节细胞可以由胶体金发出的光分辨出来，用手控的微量加样器吸取置于PCR管中。
3.从组织切片上分离单个细胞
冷冻切片5~10 μm厚，干燥过夜，次日于丙酮中固定10 min，干燥20 min。滴加适当的单克隆抗体，按ABC法进行免疫组织化学染色，采用碱性磷酸酶-快红显色，苏木精复染。在已进行染色的切片，上滴加0.01 mol/L TBS (pH7.4) 缓冲液。
光镜下先用20倍物镜×10倍目镜找到所需细胞，然后在60倍物镜×10倍目镜下，用硬质玻璃微电极毛坯(Narishige, 日本)拉制而成的直径为1~2 μm的分离微吸管仔细分离所需细胞，使其与周围的细胞分离。并将其送入用硬质玻璃微电极毛坯拉制而成的直径为10~20 μm的吸取微吸管内，通过液压传动装置将细胞吸入PCR管中。-20 ℃保存。
（二）单细胞PCR
①将单个细胞移人预先加入20 μl裂解液的PCR管中。其中包含有1×PCR反应缓冲液(50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl pH8.3, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mg/ml明胶)和0. 05 mg/ml蛋白酶K，20 mmol/L DTT, 1.7 μmol/L SDS。
②37 ℃温浴1 h后，将样品加热至85 ℃。
③将样品加至100 μl PCR反应体系，包括: 1×PCR反应缓冲液，1 μmol/L 的PCR引物(每种lμmol/L)，187.5 μmol/L的dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP， 每种187.5 μmol/L),100 ng的模板DNA和2 U的Taq DNA聚合酶。
④根据引物的退火温度和预期扩增的片段大小设计PCR反应的条件，标准的反应条件为:
95 ℃，变性5 min; 95 ℃，30 s，55 ℃(视PCR引物的退火温度而定)，30s, 72 ℃，40 s (视PCR预期扩增的片段大小而定)，循环反应30-50次; 72 ℃反应10 min。
（三）单细胞PCR产物的分析
将PCR产物直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行EB染色，在紫外照射条件下，分析扩增产物。大多数条件下一轮PCR反应得到的产物不足以用EB染色显示出来，需进行点杂交或Southern blot做进一步分析 。
1.点杂交
(1)样膜的制备
①DNA样品的预变性样品：DNA溶于水或TE中，煮沸5~10 min,冰浴中迅速冷却，使其变性。
②尼龙膜的预处理戴上干净的手套，将尼龙膜按需要剪成合适大小，并剪掉一角作为点样顺序标记。如采用手工点样，用铅笔在尼龙膜上按0.8~1.0 cm2的面积上标上小格。用蒸馏水浸湿，再浸人6×SSC至少30 min，将膜取出风于待用。
③点样可根据情况手工直接点样或用真空抽滤加样器(斑点或狭缝)点样。
手工直接点样:用微量移液器将经变性处理的核酸样品依次点到尼龙膜的标记点上。斑点直径不要过大，应控制在0. 5 cm2以内。单个样品分少量多次点样，边点样边风干。
斑点真空抽滤加样器点样:
a. 常规方法清洗加样器后，用0.1 mol/L的NaOH清洗点样器，无菌三蒸水充分冲洗
b. 将尼龙膜湿润后覆盖在加样器支持垫上(或为预先湿润的滤纸)，小心排除气泡，尼龙膜覆盖不到的部位需用Parafilm 膜封闭，重新安装好加样器，接通真空泵;
C.在加样孔加满10×SSC，抽滤至所有液体被抽干，关闭真空泵，重复一次
d.将上述经预变性处理的样品加入2倍体积20×SSC后加至各孔，真空抽滤，待全部液体抽干后，再加10×SSC抽滤两次
e. 等10×SSC抽滤完后，继续维持真空5min,使尼龙膜干燥。
④固定：点样后的样膜置滤纸上，室温自然风干，然后真空80 ℃烘烤2 h固定核酸样品。固定后的样膜，封存于塑料袋内待用(-20 ℃可保存若干月)。
(2)预杂交
将样膜用2×SSC浸湿后，放人杂交管中，加入10~20 ml预杂交液，在杂交炉中，42 ℃温育2~4 h。预杂交液各组分的终浓度为: 6×SSC, 50% 去离子甲酰胺，5×Denhardt 液，0. 5 mg/ml鲑鱼精DNA, 0. 5% SDS。
(3)杂交
①配制杂交液(终浓度)：6×SSC; 5× Denhardt液; 50% 去离子甲酰胶; 0.1 mg/ml鮭鱼精DNA;0.5% SDS。
②探针变性:采用放射性标记的双链DNA探针，需变性处理。一般将DNA探针在沸水浴中煮沸5min,然后迅速置冰浴中。
③杂交:从杂交炉中取出杂交管，弃预杂交液，加人5~ 10 ml杂交液。加人放射性标记的
探针，小心排除气泡，置42 ℃温育，一般为16~20 h。
(4)洗膜
杂交结束后， 将杂交液倒入放射性废物容器中，取出样膜，放进装有2×SSC /0.1% SDS的盘中，室温摇晃漂洗5min。2×SSC/0.1% SDS室温洗两次，每次15 min; 0. 1×SSC /0.1% SDS室温洗两次，每次15 min; 0. 1×SSC /0. 1% SDS 55 ℃洗两次，每次15 min。
(5)放射自显影
样膜经漂洗后，置干净滤纸上，吸去膜上多余的水分，外面裹一层保鲜膜。置于暗盒中，在样膜的上面压一张X光片，- 80 ℃放射自显影24~48 h后，按常规冲洗X光片：显影1~5 min;定影5 min;流水冲洗10 min，自然干燥。
(6)结果观察
根据曝光点的有无、 强弱，可以判定目的基因的有无及量的多少。利用“自动灰度扫描仪”扫描曝光点，计算积分光密度值，可以进行半定量分析。
2. Southern blot
①将PCR产物在琼脂糖凝胶(0. 65% ~0.8% )上缓慢电泳 (1V/cm), 24~48 h。
②电泳完毕后在紫外光下照相，沿凝胶边缘放置一透明荧光直尺，以便能从照片中读出DNA标准参照物的迁移距离。
③将凝胶置于数倍体积的0.25 mol/L HCI中浸泡20 min,并且温和地不断振摇。
④将凝胶浸泡于数倍体积的变性缓冲液中(1.5 mol/L NaCl, 0.5N NaOH)，浸泡30 min, 温和振摇。
⑤弃去变性缓冲液，加入数倍体积的中和缓冲液( 1 mol/L Tris HCI pH7. 4, 1.5 mol/L NaCI)，于室温不断振摇30 min。
⑥将凝胶置于20×SSPE中，室温30 min。
⑦用毛细管转移法或电转移法将DNA从琼脂糖凝胶中电转移到硝酸纤维素滤膜上。
⑧转移结束后，用铅笔标记凝胶加样孔的位置。
⑨UV照射交联(120 mJ/cm2 )。
⑩2×SSPE室温漂洗。
⑪将滤膜置于两组3MM滤纸中间，用真空炉于80 ℃干烤1h。
⑫将滤膜置于预杂交液中(10×Denhard's, 4X SET, 0.1% SDS, 0. 1% Na2H2P2O7，100 pg/ml变性的鲑精DNA)，杂交瓶中65 ℃温育1 h。
⑬将DNA探针和鲑精DNA于100 ℃加热5min使其变性，迅速置于冰上5 min。
⑮取200 μl DNA探针和100 ul (10 mg/ml) 鲑精DNA加入10 ml新的预杂交液中。将杂交瓶中 的预杂交液弃去，加入含有变性探针的杂交液。 65 ℃杂交过夜。
⑯将滤膜转移至盛有数百毫升的漂洗缓冲液(0.4×SET， 0.1% SDS, 0. 1% Na2H2P2O7)中，于65 ℃水浴摇床中温和摇动漂洗两次，每次10 min。
⑰将滤膜置于两张3MM纸中稍事干燥，用Saran 保鲜膜包好滤膜，贴上数张荧光标签，以便以后校准放射自显影与滤膜的位置。
⑱将滤膜置于X光片夹中于-70 ℃加增感屏曝光12~48 h。
⑲按常规冲洗X光片:显影1~5 min;定影5 min;流水冲洗10 min,自然干燥。
⑳根据曝光点的有无、强弱，可以判定目的基因的有无及量的多少。利用“自动灰度扫描仪”扫描曝光点，计算积分光密度值，可以进行半定量分析。
附：
20 X SET 缓冲液：3 mol/L ，NaCl 0. 4 mol/L ，Tris-HCl, pH7. 5
20 mmol/L EDTA
3.单细胞RT-PCR
①融化含有单个细胞的PCR管，在冰上加入3 μl 5% NP-40和1 μ 15 mmol/L待分析基因的反转录引物或oligodT引物。然后将PCR管加热至65 ℃，放置3 min后，于25 ℃冷却3 min后，置冰上冷却。
②向PCR管中加入2 μl 10×反转录缓冲液、2 μl DTT、1 μl 10 mol/L dNTP和0.5 μl反转录酶(如Superscript II RT), 加入无RNase的水至终体积19. 5 μl。
③将PCR管置于37 ℃，反应1 h，合成第一条cDNA链后，加热至70 ℃，保持10 min，灭活反转录酶。
④用第3步得到的cDNA混合物作为模板进行PCR反应。在PCR管中，混合下列溶液:
cDNA混合物 8 μl
20 μmol/L 上游引物 0.5 μl
20 μmol/L 下游引物 0.5 μl
10×Pfu PCR反应缓冲液 6 μl
5 U/μl Pfu聚合酶 1 μl
10 mmol/L dNTP 1.6 μl
加水至终体积60 μl。
⑤按标准的PCR反应程序进行PCR反应。通常的单细胞RT-PCR反应要进行两轮PCR反应，进行第二轮PCR反应时，以第一轮PCR反应的产物作为PCR反应的模板，设计第一轮PCR反应引物的内侧引物进行巢式PCR反应。
⑥单细胞RT-PCR产物的分析。第一轮PCR反应或第二轮PCR反应的产物在1% 琼脂糖凝胶上电泳后，用QIAquick凝胶回收试剂盒纯化回收后，进行测序。并与数据库中的序列进行比较分析。
若要进行半定量分析，可在第一轮PCR反应结束后，对PCR产物进行点杂交或Southern Blot分析。
注意事项
① 尽管单细胞PCR有许多优越性，但在操作上有较大难度，对实验室的要求颇高，工作量非常大，因此目前只有少数单位能够开展。首先由于研究对象是单个细胞，因而要严格防止污染。因此除实验器具要严格消毒，以及设置各种对照排除干扰外，操作者自身也应注意不能携带 可能造成污染的物品进入单细胞操作室。一般对单细胞PCR应采取重复实验以及双盲法。应采取以下具体措施：
a. 在进入单细胞操作室前必须沐浴，然后在准备室内换上专用制服和工作鞋，并戴上手套, 尤其要注意的是其它实验室的物品一律不得带入单细胞室；
b. 枪头、移液器、试剂等所有实验物品必须为单细胞室专用；
C.单细胞提取时所需要的微吸管必须经髙温消毒，每挑选一个细胞更换一次微吸管；
d. 免疫组化也必须在专用实验室内进行，要求与进入单细胞室相同；
e. PCR反应前各种试剂的配制、加模板、PCR反应、电泳检测PCR产物要分别在不同房间 进行；
f. 经常更换手套（尤其是在接触DNA模板和PCR产物后），采用防止气溶胶的一次性吸管 头等；
g. 设立缓冲液对照，即只吸取覆盖在切片上的缓冲液，而不吸取细胞成分，在这种情况下， PCR扩增也应该全为阴性，若出现阳性条带，证明覆盖在切片上的缓冲液内有细胞污染。
②单细胞提取的难度还在于其需要非常高的准确性，这取决于仪器设备的精度和操作者的 水平。操作时应最大限度地避免邻近细胞的污染，单细胞提取后，往往还需进行PCR反应和 DNA测序。这就对模板的量和纯度提出了较高的要求。与常规利用全组织提取DNA相比，单细 胞DNA的纯度明显增高，但量相应减少，导致单细胞PCR的扩增效率低于全组织PCR,增大 了工作量。
③ 单细胞PCR的扩增效率较全组织PCR低，其原因有如下几点：
a. 从组织切片分离单个细胞时，5~10 μ的冷冻切片使单个细胞的细胞核发生部分丢失， 细胞越大丢失成分越多，其弥补措施为增加冷冻切片的厚度，尽可能保证细胞核的完整性。
b. 单细胞操作不允许用苯酚、氯仿进行抽提，因为这会使本来已很微量的DNA丢失，采用 蛋白酶K消化，尔后再灭活蛋白酶K的方法，但是这种纯化方法不能保证每个细胞的DNA都达 到PCR扩增的要求
c. 在吸取细胞时微吸管管尖因毛细吸附作用会引起缓冲液内流，若控制不好，内流增多, 导致整个体系中缓冲液浓度改变，同样会得不到阳性结果⑺
d. 切片、免疫组织化学、单细胞提取的过程需要较长的时间且步骤复杂，可能会使细胞 DNA受到损伤。上述诸点造成单细胞扩增的效率一般最高仅为全组织的50% 左右。
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