简介

差异显示PCR (mRNA differential display PCR, DD-PCR)技术，又称差异显示反转录 PCR (dif¬ferential display reverse transcription PCR, DDRT-PCR)。这种方法将随机引物和锚定 cDNA 引物结合使用，可以获得起始于poly (A)尾并向上延伸50~600个核苷酸的片段，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将来源不同的这些片段的差异显示出来。

目前，应用于差异显示PCR的方法主要有1种：mRNA差异显示PCR。

原理

差异显示PCR的基本原理是真核细胞的mRNA含有poly (A)末端，在poly (A)前面的2个碱基12种可能的组合：前面第一个碱基（B）有G、C、T三种可能，第二位碱基（N）有G、T、 C、A四种可能。因此设计3’端引物为oligo-dT12MN（M、N分别代表A、C、G、T4种碱基的 1种，其中M不能为T）共有12种引物。

当用任何一种oligo-dT12MN对mRNA进行反转录，即可得到1/12的cDNAo为获取cDNA最大程度的PCR扩增，5’端引物设计成一组随机引物， 随机地结合在来自mRNA的cDNA上。由于结合是随机的，因此片段大小是不同的，通过测序胶电泳的条带便可分辨出来。

应用

差异显示PCR的常用应用领域如下：

（一）植物抗逆性研究

抗病性研究：采用DDRT-PCR可以了解抗病性植物与非抗病植物之间，或者植物染病前后 的基因表达的差异，从而有助于深入研究作物抗病机制。例如董海涛等对水稻抗稻瘟病近等基因 系H7R和H7S进行DDRT-PCR分析，筛选到33个抗病/致病相关的cDNA差异片段，进一步 的研究显示其中一个克隆为稻瘟病菌诱导的特异反应基因。

该研究小组分析水稻愈伤组织受白 叶枯病菌诱导的mRNA表达差异时，同样筛选到一个可能参与水稻抗病防御的RB1基因片段矣。
抗寒机制研究：Kdayrzhanova等用DBPCR和筛选cDNA文库从番茄中克隆了一个与热 诱导/冷耐受相关的新基因Le HSP17.6。

此外DDRT-PCR还广泛用于抗辐射和高温胁迫性研究、抗敏性研究、水分胁迫研究等方面，推动了对植物抗逆性机理的深入研究。

（二）营养学

人们发现营养物质的作用受基因调控，也就是说当营养素缺乏或过多时，就表现为基因水平 上某个或某些基因表达的开启、关闭或表达量的变化。DDRT-PCR为观察分析这些基因表达上 的差异提供了强有力的工具。

在铜的营养学研究中，利用DDRT-PCR对缺铜6周的雄性SD大鼠肝脏mRNA与正常大鼠 肝脏mRNA进行比较分析，筛选到一个未知基因。比较分析经视黄酸诱导的牛软骨细胞和未经 诱导的细胞，还筛选到编码一种被称为软骨源性敏感蛋白(CRAP)的新蛋白。

维生素相关研究是营养学的重要方面，传统的研究方法针对性差，比较盲目。筛选一个营养 相关基因，往往需要花费10年以上的时间。而采用DDRT-PCR则可以大大缩短这个过程。此 外，由于DDRT-PCR将表达差异的基因都展示出来，研究者就可以有的放矢地对维生素相关基 因进行研究。

多个实验室利用DDRT-PCR分别对视黄酸、维生素A、维生素3等进行研究，都 取得了一定的突破性结果，并为深入研究维生素奠定了基础。DDRT-PCR技术作为能够显示与 营养物质调控相关基因的技术，在阐明营养物质调控机理和营养缺乏病的分子基础、寻找营养相 关基因等方面发挥着更大的作用。

（三）肿瘤研究

DDRT-PCR也已广泛应用于肿瘤的病因与发病机制研究、肿瘤诊断研究和肿瘤治疗的研究, 并取得了一些成果。

例如利用DDRT-PCR技术比较肝癌病人的癌组织与正常肝组织中基因表达差异，发现了序列与人甘氨酸N-甲基转移酶(glycine N-methyltransferase, GNMT)、磷酸酯 酶高度同源的两条cDNA在肝癌组织无表达或表达很低，同时免疫组化染色证实GNMT蛋白在肝癌细胞中消失；由于GNMT在能量代谢过程中有着重要的作用，而磷酸酯酶在肝脏对毒物的谢中起主要作用，因此推断肝癌易感性增强可能与这两个基因表达下调有关。

化学药物治疗仍是目前中晚期肿瘤必需的治疗手段，但耐药问题一直难以解决。在体外细胞 培养模型中研究的耐药机制，如多药耐药复合体表型等与临床观察和治疗反应并不一致。Bertram等通过比较对阿霉素具有耐药性和不具有耐药性的人结肠癌细胞株，发现耐药株中过度 表达核糖体蛋白L4、L5,延长因子PTI-1,这样就从基因角度促进了对人体耐药机制的研究。

此外，多年来人们期望能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物以用于早期诊断、判断预 后及疗效评估。但至今为止，胃肠道以及其它脏器肿瘤标志物的研究仍无突破。

DDRT-PCR可 以任意选择相互比较的对象，为正常组织、癌前组织和癌组织之间进行有意义的比较和寻找这些 阶段性病变之间的细微差异上开辟了一条新的途径。Fournier等应用肿瘤病人与正常人的外 周血进行DDRT-PCR分析，发现肿瘤播散的指标HLM,为DDPCR标本的选择开辟了一个新的领域。

（四）眼科学

Chiplunkar等为了研究正常角膜与圆锥角膜的差异，以培养的正常和圆锥角膜基质细胞 为材料，进行了 DDRT-PCR。差异基因产物与白细胞普通抗原相关蛋白（LAR）有100% 同源性。

Northern. Western.免疫组化法证实该基因仅在圆锥角膜及其培养物中有表达，从而为阐 述圆锥角膜的发病机制提供了分子生物学依据。

晶体上皮细胞负责晶体的生长、分化，含有高活性酶系统，在邻近的纤维细胞物质代谢中起 重要作用。晶体上皮细胞dens epithelial cells, LEC）受损、酶系统的破坏，可能与白内障形成 相关，其基因表达和蛋白合成的异常是导致晶体混浊的直接原因。

Kantorow等研究对比老年性 白内障和正常人的LECs,发现三个差异：①Osteonectin （骨桥蛋白）即SPARC （富含半胱氨酸 的分泌性酸性蛋白），它是一种糖蛋白-C^+结合蛋白，通过与细胞基质相互作用来调节细胞生 长，它可以直接作用方式调节血小板衍生生长因子（PDGF）活性，小鼠。

steonectin基因缺失导 致年龄相关性白内障，而在人类老年性白内障，该基因呈上调表达，提示该基因与白内障的发生 发展有关；②P2A-RS是一种三聚体丝氨酸-苏氨酸特异的蛋白磷酸酶2A复合物的调节亚基， 通过负调控P34cdc2激酶活性而参与细胞周期的调控，是有丝分裂抑制剂，P34cdc2与最初纤维 细胞分化有关，所以P2A-RS必然参与晶体细胞有丝分裂调控，对于晶体的发育和白内障的形成 起重要作用，P2A-RS在白内障组表现为下调；

③metallothionein a （MET ）是一种低分子量 金属结合蛋白，与许多细胞解毒和应激反应有关。它是由于激素应答而合成的自由基净化剂以及 由于过度氧化刺激诱导的毒性金属、癌基因、化学物质等的净化剂。肝细胞的X射线照射和紫 外线介导的DNA损伤也可以诱导MET,在白内障患者为上调表达，是晶体对毒物、氧化和其 它刺激因素的反应，也提示氧化刺激是白内障形成的重要因素。

（五）激素研究

性腺激素作用的分子机制尚不十分清楚。美国一位学者利用DDRT-PCR技术，从5a还原酶缺乏性T淋巴细胞杂交瘤中克隆到一种雄激素靶基因TDD5,该基因的表达可在睾酮和二氢 睾酮作用后2h被抑制，而且这两种激素的基因对TDD5靶基因的抑制具有差异性，睾酮的抑制 反应强于二氢睾酮。

进一步研究发现TDD5可在多种组织表达。该基因的发现有助于研究不同雄 激素不同作用强度的分子机制。此外用同样方法，还发现了雌激素和孕激素所调节的基因。

（六）免疫学应用

DDRT-PCR技术已在免疫学研究中被广泛应用。例如为了研究自然免疫应答过程中LPS反应可能涉及的转录调节，Jin等对C3H/HeN和C3H/HeJ （LPS受体突变细胞系）两种细胞系 进行了 DDRT-PCR 分析。发现了2 个差异表达：matrix metallproteinase-9 （MMP9）和 secretory leukocyte protease inhibitor （SLP1）。

进一步的研究发现LPS应答可能具有两种不同的调节途径， 而SLP1则可能是LPS的拮抗物。在研究P53诱导的细胞凋亡研究中，Amson等构建P53温 度敏感型髓白血病突变细胞系，然后利用DDRT-PCR技术发现在诱导凋亡的第一个小时里存在 10个表达的差异，其中包括磷酸酶C3 4, IFM1等。

操作方法

差异显示 PCR（基本方法一）

简介

差异显示PCR

原理

差异显示PCR技术的基本原理是以不同来源的细胞或不同状态的同种细胞作为研究对象。 分别抽提各自的总RNA,然后以oligo-dT12 MN为锚定引物在反转录酶作用下将mRNA反转录 成cDNA,随后采用5/端的随机引物和3’端的oligo-dT12MN引物以及同位素标记的dNTP进行 PCR扩增反应。

 

所得PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后作放射自显影，对X光片上显示 的条带进行对比分析，从中可以找出差异表达的cDNA片段。从胶上切下这些表达差异的条带， 用相应的引物和条件进行PCR再扩增，克隆所得的PCR产物进行核昔酸序列分析，并在基因序 列数据库中作同源比较，即可知道是已知基因、还是未知基因。

材料与仪器

器材：PCR仪、离心机、电泳仪

试剂：
①氯仿，异丙醇，75% 乙醇。
②无RNA酶的水或1 % SDS溶液［无RNA酶水配制：在无RNA酶的玻璃瓶中，配制 0.01% （体积分数）焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate, DEPC）水溶液，放置过夜后高压灭菌。并用该水配制SDS溶液］。
③RNase-Free DNase 和 RNase 抑制剂（RNase Inhibitor）。
④dNTP混合液
⑤TaqDNA聚合酶及其10×PCR缓冲液
⑥50 mol/L MgCl₂
⑦3 mol/L 乙酸钠
⑧无水乙醇
⑨10 mg/ml糖原

步骤

差异显示PCR的基本过程可分为如下几步：

 

（一）RNA的制备

下面以Introvigen公司的Trizol试剂提取总RNA方法为例。

(1) 材料处理
①组织:加入适量Trizol试剂(1ml Trizol试剂/50-100 mg组织)，搅匀。样本的体积不能超过加入的Trizol试剂体积的10%。
②单层细胞:在3.5 cm培养平皿中直接加入1 ml Trizol试剂，用移液枪打散混匀。
(2) 相分离：将混匀的样本在室温放置5 min, 使核蛋白复合体充分裂解。按0.2 ml氯仿/1 ml Trizol试剂的比例加入适量氯仿，用力振荡15 s, 室温放置2~3 min。4 ℃，15000g 离心15 min，离心后混合物应该分成底部淡红色的氯仿层、中间相和上部无色的水相。水相的体积应该约占加入的Trizol试剂的60%。
(3) RNA提取：把水层转移到一个新的离心管中。按0.5 ml异丙醇/ 1 ml Trizol 试剂体系比例加入适量异丙醇。将样本在室温下放置10 min。4 ℃，12000 g 离心10 min。离心后可于离心管的底部或侧面观察到凝胶状RNA沉淀。
(4) RNA洗涤：弃除上清，在每1 ml Trizol试剂体系中加入1 ml 75% 乙醇，摇匀，充分洗涤RNA沉淀，4℃，7500 g离心5 min。
(5) RNA溶解：将沉淀空气干燥， 但注意不要过于干燥，否则不易溶解，导致A20/280<1.6。干燥后将沉淀溶于150 μl无RNase的水(DEPC水)中。
(6)去除DNA污染在反应管中加入下列试剂:
RNA                                         150 μl
RNase 抑制剂                           1 μl
RNase-Free DNase(40U/μl)     4 μl
10×反应缓冲液[400mmol/L Tris-HCL(pH8.0)，100 mmol/L MgSO4, 10mmol/L CaCl2]      20 μl
无RNase的水                            25 μl
混合均匀后，37 ℃温育30 min。

（二）模板RNA浓度的优化

(1) cDNA第一链的合成将浓度为1μg /μl的RNA稀释为0.1μg/μl和0. 01μg/μl两个浓度，以获得1μg、0.5μg、 0. 1pg、0. 05μug四个(或者更多) RNA梯度。在3'锚定引物库中选择一套简并引物，以不同浓度的RNA模板进行反转录反应。

首先在反应管中加入下列成分：

RNA模板    依梯度加入相应体积
dNTP混合液(10mmol/L)                            1 μl
3'锚定引物                                                 2 μl
无RNase的水                                             补至12 μl

65℃温育5min,迅速转人冰水中，加人下列成分:

5×first-strand缓冲液[ 250mmol/L Tris-HCI (pH8. 3)，375mmol/L KCl,15mmol/L MgCl2]       4 μl
0.1mol/L DTT                                        2 μl
RNase抑制剂                                         1 μl
混匀后，42 ℃保温2min,加入1 μl (200 U) SUPERSCRIPTⅡ混匀，42 °C继续反50 min,70 ℃加热15 min后取出- 20 ℃保存。

(2)取cDNA第一链产物，进行第二链合成和PCR扩增
在反应管中加入下列成分：
cDNA第一链产物    3 μl
3'锚定引物              2 μl
5'随机引物              2 μl
10X PCR缓冲液[ 200 mmol/L Tris-HCl (pH8. 4), 500 mmol/L KCl]    2 μl
dNTP混合液(10mmol/L)    1 μl
Taq DNA聚合酶(5U/μl)    0.5 μl
 [α-33P]dATP或[α-35s]dATP(3000Ci/ mmol)    1 μl
MgCl₂ (50 mmol/L)(如果PCR反应0.5 μl缓冲液中含有MgCl₂ ,则不必添加)                         0.5 μl
无RNase的水    补至        20 μl
如果所用PCR仪无加热盖，则需在反应管中滴加矿物油。

PCR反应条件:先94 ℃ 2 min; 然后94 ℃ 30 s，40℃ 30 s, 72 ℃延伸30 s，共10个循环；再94 ℃ 30 s，45 ss 530 s ，72 ℃延伸30 s，共25个循环；最后72 ℃延伸2 min。反应产物-20 ℃保存。

(3)凝胶电泳分析：现配制 DNA序列分析用的电解质梯度聚丙烯酰胺凝胶。每只PCR反应管中加5μl测序胶上样缓冲液，85 ℃水浴5 min后迅速转至冰水中，随后上样电泳分离。待指示剂二甲基蓝至凝胶长度2/3处结束电泳。

 

抽干凝胶，放射自显影底片下压片。一般理想的差异显示带型应可清晰分辨200左右条带，因此通过观察不同浓度来源RNART-PCR扩增反应产物的DNA条带，即可确定最适的RNA量(浓度)。 需要注意的是，凝胶浓度也会对结果产生一定的影响，在确定最适RNA量同时也应对凝胶浓度加以优化。

（三）DDRT-PCR

1. 根据不同的研究要求选择不同的引物组合

一般DDRT-PCR采用12个3’锚定引物和24个5'随机引物，但工作量极大：12个3’锚定引物，分别和24个5’随机引物反应，那么两个样品的差异显示共需作576个反应。如果重复则为1152个反应。同样，选择4套3’锚定简并引物，与24个5’随机引物，仍需作192个反应。

 

不过如果是初步试验以摸索条件或者鉴定新基因，可以减少分组，工作量也大大降低。例如釆用4组简并引物(T12MA、T12MT. T12MC和T12MG)或使用3组简并引物(T12GN、T12AN. T12CN),和8组5'随机引物反应。如3个3’锚定简并引物，与8个5’随机引物，只需要作48个反应即可。但除非是为了初步摸索条件或者鉴定新的基因，否则仍需使用完整的引物组分，以获得 较完整的表达基因谱。

2. 应用所选的引物组合和最适的RNA浓度进行DDRT-PCR反应
按前述步骤对扩增产物进行电泳分离和比较分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同样品来源而 采用相同的引物对的扩增产物应放在凝胶相邻的泳道上。

 

（四）差异条带的克隆、分析和鉴定

①将差异显示条带对应的胶条和滤纸用干净的刀片切下，置于微型离心管中，加100 μl水，室温放置30 min后沸水浴15 min，高速离心2 min,将上清转人新的管中。
②加人10 μl 3 mol/L乙酸钠、5 μl 10 mg/ml糖原，加400 μl无水乙醇，-70 ℃放置30 min。高速离心10 min,弃去上清，用500 μl 85% 乙醇洗涤沉淀一次，空气干燥，溶于10 μl水中。
③用该DNA作模板，进行PCR扩增，在反应管中加人下列成分:
DNA                               3 μl
相应3'引物                      2 μl
相应5'引物                      2 μl
dNTP混合(20mmol/L)    1 μl
10X PCR缓冲液[200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),

500 mmol/L KCI]            2 μl
TaqDNA聚合酶(5U/μl)    0.5 μl
MgCl₂ (50 mmol/L)        0.5 μl
加水补至20 μl，并按下列条件进行PCR反应: 94 ℃ 2 min; 94 ℃30 s，42 ℃30 s，72 ℃30 s, 共30循环; 72 ℃ 2 min。
④取2 μl进行1% 琼脂糖凝胶电泳，估计PCR产物产量，并确定其大小是否与预期一致。
⑤将反应产物连人克隆载体，如Promega公司的pGEM T-easy载体。如果所用高保真Taq酶带有3'→5'外切酶活性，PCR产物无A末端，则需通过下列步骤获得带有dA尾的PCR反应产物:
PCR产物(建议纯化)    4 μl
10XPCR缓冲液[200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4), 500 mmol/L KCI]    1μl
不带有3'→5'外切酶活性的Taq酶     1 μl
MgCl (25 mmol/L)                        1 μl
dATP(10 mmol/L)                          2 μl
加水至10 μl,在70℃反应30 min.
⑥连接产物转化相应的宿主菌，挑取培养平皿上至少6个转化菌落，提取质粒，用相应的限制性内切酶进行酶切分析。测定序列并对其进行比较分析，查询核酸数据库，确定是否为新的基因片段。
⑦利用NB杂交、RNase保护、定量PCR等方法对所获得的差异显示cDNA条带进行验证，建议使用一种以上的确证方法。