简介

数字PCR (digital PCR)是将传统PCR的指数倍信号转换成线性的数字信号，通过特定的 仪器读值，并利用统计学方法来分析PCR产物。
目前用于数字PCR的方法主要有1种：普通数字 PCR。

原理

数字PCR的基本原理是通过将一个样本分成上百或上千份，使每个反应槽中尽可能只包含一个拷贝的目标分子(即模板)，然后在每个槽中都加入荧光标记过的 探针和DNA聚合酶，批量扩增DNA样本，最后通过荧光信号的读值来反映目标分子的PCR扩 增。

数字PCR的出现显著提高了生命科学研究的效率，使生物学家可以快速、高通量检测病人 样本中致病基因的许多变化，包括基因突变、等位基因不平衡的识别等。

应用

数字PCR常用应用领域如下：检测肿瘤组织或DNA样品中的位点突变和等位基因不平衡。

操作方法

🔥 普通数字 PCR

简介

数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。

原理

数字PCR的基本原理是将分析样品DNA被稀释成大约平均每两个孔含有一个样本分子，然后平分到多孔板中。在最佳条件下利用PCR扩增单个拷贝的模板。

扩增产物和分子信标(molecular beacon, MB)荧光探针进行杂交，并根据不同的荧光来检测序列特异的PCR产物。数字PCR直接计算两两相比样本中的每个样品等位基因的数量 (例如，父系来源样本相对母系来源样本，或者是野生型相对突变型)。

同时，可利用统计学分析方法来分析两个样品差异的可靠性，例如贝叶斯似然方法(Bayesian-type likelihood methods)。

分子信标探针工作原理：M是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核甘酸探针，它的5’端连接有荧光基团，3'端连接有猝灭基团(Dabcyl基团)，两端的核酸序列互补配对，因此3’端的猝灭基团和5’端的荧光基团紧紧靠近，荧光基团被激发后产生的光子被猝灭基团猝灭。

当MB引物和模板配对时，MB引物的5’端和3’端将被分开，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团和猝灭基团分开，猝灭作用被解除。当荧光基团被激发时产生能量，以红外光波形式释放出来。

材料与仪器

器材：

PCR仪、离心机、荧光分光光度计或双通道荧光定量PCR仪、紫外分光光度计。

试剂：

(1) 缓冲液和溶液: 67 mmol/L Tris (pH 8.8),

16.6 mmol/L (NH4)₂SO₄, 6.7 mmol/L MgCl₂，

10 mmol/Lβ-巯基乙醇，

20 mmol/L dATP , 20 mmol/L dCTP, 20 mmol/L dGTP, 20 mmol/L dTTP, 6%  (体积分数)DMSO。
(2) 酶Taq聚合酶。
(3) 核酸和寡核苷酸
① 外源或目的DNA。
② 引物和探针: 1 μmol/L引物F1, 1 μmol/L引物R1, 5 μmol/L引物INT, 1 μmol/L绿色荧光分子信标(MB-green), 1 μmol/L红色荧光分子信标(MB-red),引物均溶于50 μmol/L TE缓冲液中。

步骤

数字PCR的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

引物F1和引物R1是用于扩增目的片段的两段特异引物；引物INT是用于 在PCR扩增中产生单链目的片段；MB-red是一段MB探针，用于检测目的片段之外的基因组上的任一片段的PCR产物，包括野生型和突变型；MB-green是一段MB探针，用于检测野生型目的片段的PCR产物。

扩增目的片段内的突变能显著阻止PCR产物与MB-green探针 的杂，通过比较MB-green/MB-red的荧光信号强度可以知道野生型DNA占总样本的比例，从而知道突变型DNA占总样本的比例。

（二）PCR扩增反应

A. 将从组织或者体液中提取的基因组DNA样品梯度稀释，然后加入到96孔PCR板中，大 约每个孔中含有0.5个基因组DNA。

注意：

稀释后的DNA样品需要使用常规PCR反应进行检测，以确定每孔中加入约0.5个基因组 DNA。每个孔模板量约为1. 5pg,即定义为每个孔中含有0.5个模板分子。

B. 按以下各成分配成工作液700 μl，然后在96孔PCR板的每孔中加入7 μl工作液，混匀后进行PCR反应。

PCR工作液配比：
10×扩增缓冲液                                  70 μl
20 mmol/L 4种dNTP混合液(pH8.0)   35 μl
20 μmol/L正向引物F1                        35 μl
20 μmo/L反向引物R1                         35 μl
1~5U/μl Platinum○RTaq DNA聚合酶 35 U
H₂O                                                   490-518 μl
总体积                                                700 μl

标准PCR反应条件:

试剂                    浓度
MgCl2                6.7 mmol/L
Tris(pH 8.8)        67 mmol/L
(NH4)2SO4        16.6 mmol/L
β-巯基乙醇         10 mmol/L
dNTPs                1 mmol/L
DMSO                6% (体积分数)
引物                    1 μmol/L
Platinum○RTaq DNA聚合酶
0.05 U/μL
模板DNA             0.5个分子

C. 在反应混合液的上层加一滴透亮的轻矿物油(约50 μl)，防止样品在PCR反应多个循环过程中蒸发。
D. 放置96孔PCR板在PCR仪上。按以下方法进行PCR扩增。如下：
  94 ℃，1 min
  94 ℃，15 s
  55 ℃，15 s     进行60次循环
  72 ℃，15 s
  70 ℃，5 min
反应体系马上进行荧光分析或在室温下保存最多36h，然后进行荧光分析。

（三）荧光分析

A. 按以下各成分配制工作液400 μl,在96孔板的每孔加入3.5 μl工作液:
10×扩增缓冲液                                  40 μl
20mmol/L 4种dNTP混合液(pH8.0)    20 μl
20μmol/L正向引物INF                       100 μl
20μmo/L MB-green                           20 μl
20μmo/L MB-red                               20 μl
1~5U/μl Platinum○RTaq DNA聚合酶  40 U
H2O                                                   160-192 μl
总体积                                                 400 μl

标准数字PCR反应条件：
试剂    浓度
MgCl₂            6.7 mmol/L
Tris(pH 8.8)    67 mmol/L
(NH4)2SO4    16.6 mmol/L
β-巯基乙醇     10 mmol/L
dNTPs            1 mmol/L
DMSO            6% (体积分数)
引物INT          5 μmol/L
MB-green      1 μmol/L
MB-red          1 μmol/L
Platinum○RTaq DNA聚合酶
0.05U/μL

B. 以6000g离心96孔PCR板20s。
C. 将96孔PCR板放入PCR仪中，按以下方法进行PCR扩增。相应的循环条件与温度 如下：
  94℃，1min
  94℃，15s
  55℃，15s     进行10-15次循环
  72℃，15s
  94℃，1min
  60℃，5min

D. 将PCR板在室温下孵育10-60 min，然后放入荧光分光光度计中，用485 nm/530 nm波长 激发 MB-green荧光，530 nm/590 nm 波长激发 MB-red。计算：red/green比 = MB-red荧光强度/ MB-green荧光强度，并使用阳性对照来校正red/green比。

注意事项

① 数字PCR扩增过程中不能使用巢式PCR,因为如果在进行数字PCR时使用巢式PCR不 仅使用不方便，而且会导致污染问题。
② 需选择加热后才会有活性的DNA聚合酶。
③ 数字PCR反应不需要很长时间(约2.5 h),但比普通PCR需要更多的循环次数，远高于 通常所使用的循环次数。因为在某些孔中的模板可能经过几次循环之后才开始扩增反应。高次数 循环反应能保证只要孔中有模板，每个PCR孔中都能产生几乎相等的PCR产物。
④ 用激发/发射波长485 nm/530 nm检测MB-green荧光，激发/发射波长530 nm/590 nm检测 MB-red荧光。在没有加入DNA模板分子时，每孔的荧光通常在10000-20000特定荧光单位 (specific fluorescence units, SFU)。