简介

PCR在临床诊断及流行病调查中的应用是通过介绍多种PCR的实验方法、原理、步骤，从而确定不同的PCR方法在临床诊断和流行病调查中的实际应用。

目前，用于PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的方法主要有7种：表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用、双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用、降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用、16 SrRNA PCR在临床诊断及流行病调查中的应用、PCR偶联连接酶链式反应在临床诊断及流行病调查中的应用、快速PCR在临床诊断及流行病调查中的应用和稀有限制性位点PC在临床诊断及流行病调查中的应用R。

原理

根据实验方法的不同，对应的原理也有所不同：

表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是需要发现某个病原体的特异表位，再找出该特异表位相对应的DNA序列，然后就可用常规PCR方法把编码特异表位的DNA扩增出来而达到对某病原体的诊断。

双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是先将待检病原菌相关的单克隆抗体标记在胶体金颗粒上制成免疫胶体金试剂，通过特异性抗体的免疫反应将待检病原菌吸附在胶体金颗粒上，然后提取病原菌的DNA,通过PCR反应来实现遗传物质的进一步放大。PCR 的基本原理和操作方法与常规PCR类似，不同之处仅在于用生物素和地高辛分别标记PCR的上下游引物，因此扩增产物也带有双标记，可进行免疫学检测，从而可以快速、灵敏和准确地检测食品中污染的病原菌。

降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是每一个(或n个)循环降低1 °C (或n °C)退火温度，直至达到一-个较低的退火温度，这个温度称为“touchdown"退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。

据统计，正确和非正确退火温度之间的1 °C差异将造成PCR产物量的4倍差异，如果相差5 ℃，就会产生45(1024) 倍的优势，因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。退火温度起始在高于计算的Tm值的15C左右，在接下来的循环中，退火温度以每次1~2 ℃逐渐降低，直到Tm值以下5 ℃,当达到特异的引物模板结合的Tm值时，扩增就会开始。

当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会有一个几何级数的起始优势，在剩余反应中，特异产物优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。这种方法主要用于避免非特异PCR产物的出现，尤其是当使用复杂的基因组DNA模板，非特异的退火更容易发生时。

降落PCR中正确的产物得到富集，原理在于温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严紧性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争)。

但是，降落PCR无法改善扩增效率低的问题，-般用于在杂模板中提高扩增特异性。

16 SrRNA PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是细菌的核糖体RNA (rRNA)按沉降系数分为5S、16S 和23S,其编码基因(rDNA) 长度依次为120个、1540个及3300个核苷酸。

典型的原核生物大肠杆菌核糖体是由50S大亚基和30S小亚基组成的。在完整的核糖体中，rRNA约占2/3,蛋白质约为1/3。50S大亚基含有34种不同的蛋白质和两种RNA分子，相对分子质量大的rRNA的沉降系数为23S,相对分子质量小的rRNA为5S。

30S小亚基含有21种蛋白质和一一个16S的rRNA分子。rRNA基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守。rRNA基因包含5'端到3'端的若干种成分，分别是16S rDNA、间区、23SrDNA、间区和5SrDNA。16SrDNA基因是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，它集保守性和变异性于一身，存在于所有细菌的染色体基因组中。

PCR偶联连接酶链式反应在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是通过常规PCR扩增待检基因，用设计的简并引物与该基因进行复性，通过连接酶将匹配分子连接在一起的反应。

快速PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是与常规PCR相同，不同之处在于缩短每个步骤所需时间和温度转换时间，
提高PCR聚合酶的延伸活性、延伸速率必将缩短整个PCR反应所需时间。

稀有限制性位点PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是模板是用两种限制性内切酶消化的基因组DNA,一种限制性内切酶在基因组中具有稀少的酶切位点(例如XbaI，其识别序列为T/CTAGA),另一种限制性内切酶在基因组中酶切位点较多(例如HhaI，其识别序列为GCG/C)。

基因组消化的过程见图12-17(a)①。用两种酶消化的基因组DNA产生了具有黏性末端的限制性片段，在这些黏性末端通过连接反应连接上双链接头AX和AH。接头(AX和AH)和引物(AH1、 PX、PX-G、 PXC、PX-T、 PX-A) 的组成和序列见表12-3。连接的过程见图12-17(a)②。

两种接头都是由长短两个寡核苷酸链组成，在较低的温度退火结合在一起形成双链，结合在--起的双链可以有效地进行连接反应;在较高的温度下长短两个寡核苷酸也可以变性分离形成单链。短寡核苷酸链(AH2 或AX2)连接到限制性片段上后，将无法再参与PCR。只有长寡核苷酸链(AH1或AX1)参与PCR。在HhaI接头AH中长寡核苷酸链AH1连接到HhaI酶切产生的限制性片段5'凹陷端。

Xba I接头AX中的长寡核苷酸链AX1磷酸化后连接到XbaI酶切产生的限制性片段3'凹陷端，而AX中的短寡核苷酸链AX2没有磷酸化，所以AX2不参与连接。连接好的片段就可以作为模板进行PCR了。在PCR反应中，只有少数连接有XbaI接头的片段才可与引物PX结合。

由PX引物进行的单链延伸也就产生了引物AH1的结合序列，这样就可特异性地扩增XbaI -HhaI片段。PCR扩增的整个过程见图12-17(a) ③~⑥。两端只有Hha I位点的片段是不能扩增的，因为不会产生AH1引物的结合序列。不扩增的原理见图12-17(b)。

需要指出的是，引物PX是接头寡核苷酸AX1的反向互补序列并在3'端另加一-碱基A得到的。在3’端加一-碱基A的目的是防止引物PX与在连接反应中可能形成的接头引物二聚体的结合。

为了增加PCR的特异性，可以合成另外4种引物(PX-G、 PX-C、PX-T、PX-A)， 每一种引物均在3'端分别再加一一个碱基(G、C、T、A)。这样，每一种引物都可特异性地扩增出Xba I -Hha I片段混合物中的特异片段，此特异片段根据XbaI位点下一个碱基的不同而不同，图解示意见图12-17。

操作方法

表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用

简介

表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用是由于扩增这段位点可以用于检测相应疾病而且具有特异性的一种方法。

原理

表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是需要发现某个病原体的特异表位，再找出该特异表位相对应的DNA序列，然后就可用常规PCR方法把编码特异表位的DNA扩增出来而达到对某病原体的诊断。

用途

表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用可用于依赖于某一病原体的特异表位，如果能够知道某-病原体的表位，就可使用常规PCR对其检测，特异性特别好。

 

以下是用引物LDS和LDK对从几个病人组织中分离的黑热病皮肤和内脏利什曼原虫等的DNA进行特异表位PCR的结果。如图12-2所示。本方法可以用于扩增各种相应疾病的特异免疫显性位点，可以很好地区分同源菌株或相似疾病的DNA,所以可以对精确的诊断和有效的治疗提供依据。

材料与仪器

试剂：

①10×PCR缓冲液

(0.1 mol/L Tris-Cl pH8. 8, 15 mmol/L MgCl₂,

0. 5 mol/L KCl和1% Triton X 100)；
②待测的DNA模板；
③250 pmol/L dNTPs,
④10 pmol. 上游引物LDS；
⑤10 pmol 下游引物LDK；
⑥1. 0 U Taq DNA聚合酶；
⑦含0. 5 μg/ml EB的2% 琼脂糖凝胶。

步骤

表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本过程可分为如下几步：

A.配制PCR反应体系。

待检测的模板：1 μl(不少于0.5pg)；
dNTPs(2.5 mmol/L)：1 μl；
10× PCR缓冲液：2.5 μl；
上游引物LDS( 10 pmol)：1 μl；
下游引物LDK( 10 pmol)：1 μl；
ddH₂O：18 μl；
Taq DNA聚合酶(1.0 U/μl)：0.5 μl；
总体积：25 μl。

B. 设置PCR反应程序。
95 ℃：5 min；
95 ℃：1 min；
Tm-10 ℃：1 min；
72 ℃：1 min；
72 ℃：10 min。
设置PCR循环次数为30个循环。

注意事项

这种PCR可以探测0.5 pg的模板DNA，如果将PCR扩增出的产物作为内在探针用2P标记后与转移到硝酸纤维素膜的DNA杂交，那么探测灵敏度可提高10倍，可探测0.05 pg的DNA。

双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用

简介

双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用是A. Lermo等人提出的一种新的可以替代传统的食品检测的方法，实现了快速、实时、多元的对食品污染的检测。

原理

双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是先将待检病原菌相关的单克隆抗体标记在胶体金颗粒上制成免疫胶体金试剂，通过特异性抗体的免疫反应将待检病原菌吸附在胶体金颗粒上，然后提取病原菌的DNA,通过PCR反应来实现遗传物质的进一步放大。

 

PCR 的基本原理和操作方法与常规PCR类似，不同之处仅在于用生物素和地高辛分别标记PCR的上下游引物，因此扩增产物也带有双标记，可进行免疫学检测，从而可以快速、灵敏和准确地检测食品中污染的病原菌。

用途

双标记PCR可用于对污染了食物的各种病原菌进行检测，与用敏感电极m-GEC进行电化学检测结合，提供了一-种快速、经济、灵敏的对致病菌定性分析的方法。

材料与仪器

试剂：

①从病原菌中提取的模板DNA,生物素；
②地高辛；
③Taq DNA聚合酶；
④10X×Taq酶反应缓冲液(0.1 mol/L Tris-Cl pH 8.8，15 mmol/L MgCl，0.5 mol/L KCl，1% TritonX 100)；

⑤250 μmol/L dNTP；
⑥用生物素和地高辛标记的上下游引物，浓度均为10 pmol；
⑦含0. 5 μg/ml EB的1% 琼脂糖凝胶。

步骤

双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本过程可分为如下几步：

A.配制100 μl的PCR体系。
10X×Taq酶反应缓冲液：10 μl；
下游地高辛标记引物(10 pmol)：1 μl；
DNA模版(2 μg/l)：1 μl；
Taq DNA聚合酶(1.0 U/μl) ：0.5 μl；
dNTP (250 μmol/L)：1 μl；
上游生物素标记引物(10 pmol)：1 μl；
加ddH₂O至100 μl。

 

B.设置PCR反应程序。
95C：5 min；
95C：30 s；
60°C：30 s；
72°C：30 s；
72C：7 min。
PCR分别在循环次数为5、10、15、20、25、30 循环时停止。

注意事项：

在相同的100 μl 的反应混合体系和条件中变化模版DNA的量(7种各相差10倍的稀释度，从4.5 ng/μl到4. 5 fg/μl)，DNA扩增反应分别在第5、10、15、 20、25、30 循环停止。

 

所有的扩增反应包括-一个空白对照(不加病原菌DNA模版)。扩增产物通过电泳分析。由于引物是由生物素和地高辛标记的，扩增产物的末端也应该分别带有双标记，因此可以进行免疫学检测。

注意事项

1.引物要设计在致病菌基因序列的共有区，此外要保证双标记PCR扩增产物的特异性。
2.用电化学方法检测双标记产物的方法十分灵敏，在PCR反应10个循环后，4.5 ng/μl和0.45 ng/μl的病原菌基因组DNA可以分别用Av-GEB和m-GEC方法检测到。

降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用

简介

降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用是代表了一种完全不同的PCR优化方法，并不去尝试改变缓冲液、循环条件等，优化只集中在一个参数一退 火温度上，并且在一个程序中，可采取一系列不同的退火温度。

原理

降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是每一个(或n个)循环降低1 °C (或n °C)退火温度，直至达到一-个较低的退火温度，这个温度称为“touchdown"退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。

 

据统计，正确和非正确退火温度之间的1°C差异将造成PCR产物量的4倍差异，如果相差5℃，就会产生45(1024) 倍的优势，因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。

 

退火温度起始在高于计算的Tm值的15C左右，在接下来的循环中，退火温度以每次1~2 ℃逐渐降低，直到Tm值以下5 ℃,当达到特异的引物模板结合的Tm值时，扩增就会开始。

 

当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会有一个几何级数的起始优势，在剩余反应中，特异产物优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。

 

这种方法主要用于避免非特异PCR产物的出现，尤其是当使用复杂的基因组DNA模板，非特异的退火更容易发生时。

 

降落PCR中正确的产物得到富集，原理在于温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严紧性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争)。

 

但是，降落PCR无法改善扩增效率低的问题，-般用于在杂模板中提高扩增特异性。

用途

1.降落PCR有着很广泛的应用，主要用于增加PCR的特异性和敏感性。例如在临床诊断方面，引起间质性浆细胞肺炎( pneumocystis carnii pneumonia)的卡氏肺孢子虫的检测，传统的检测方法是组织的显微镜检测，费时，而且敏感度不够，现在有很多研究者使用PCR的方法进行检测，他们把降落PCR与定量PCR结合起来，检测样品中的病原数量，敏感性好，精确度也高。

2.降落PCR的另一个应用是在确定已知氨基酸序列肽的DNA序列。具体过程如下:使用两条与已知序列肽两末端可能配对的简并引物，需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列，5'和3'引物各长18个碱基(6 个氨基酸)，两者之间有-一个碱基或更长的间隔，进行“touchdownPCR"。

 

由这种方法将获得大量的产物，但因为由肽序列可以知道引物之间的确切距离，所以可以根据产物的大小来选择所需要的产物。该方法的优点在于可以富集引物与模板正确配对的产物。

 

如果克隆和测序几个PCR产物，将可以确定肽的正确编码DNA序列，可用于设计进行杂交的寡核苷酸。该技术特别适用于由Ser, Lys和Arg (每个有6个密码子)构成的多肽。

材料与仪器

试剂：

①10× PCR缓冲液: 15 mmol/L MgCl₂，500 mmol/L KCl, 100 mmol/L Tris-Cl，0. 1%  (体积分数) Triton X-100；
②dNTP混合液:每种脱氧核糖核苷酸的浓度为25 mmol/L；
③正、反向特异引物:两者的引物均为10 μmol/L；
④模板:可以是cDNA、基因组DNA或其它DNA；
⑤TaqDNA聚合酶；
⑥高压灭菌去离子水；
⑦用于琼脂糖凝胶电泳的试剂；
⑧PCR扩增仪:具有降落PCR程序，如PE Genamp PCR System 2400。

步骤

降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本过程可分为如下几步：

A. 设立50μl的PCR反应体系在0.25 ml的PCR管中，分别加入:
10× PCR缓冲液：5 μl；
DNA模板：5 μl(100 ng)；
2.5 mmol/L的dNTP混合液：1 μl；
Taq DNA聚合酶(5 U/μl)：0.5 μl；
10 μmol/L的外引物(P1、P2)各1 μl；
H₂O至50 μl。

注意事项：如果PCR仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油(约50 pul)。将PCR试管放人到PCR仪上。

B. 设置PCR反应条件 常规PCR方法一般是25~35个循环，降落PCR一般要比它多5~10个循环，为35~40个循环，因为降落PCR程序开始的温度高于最适退火温度(未知)，在降落PCR程序中，有效的扩增直到运行几个循环(不确定)后才开始，为了补偿，降落PCR要比常规PCR多运行几个循环。下面给出一个降落PCR的程序:

①94 °C预变性3 min;
②94 °C变性30 s，65 °C退火 30 s，72 °C延伸1 min (目的片段为1 kb) ;
③以后每个循环退火温度降低1 °C，共20个循环一退火温度从65 °C降落到45 °C;
④94 °C变性30 s，45 °C退火30 s，72 °C 延伸1 min, 15~20个循环; .
⑤72 °C延伸10 min;
⑥4 °C保存。

注意事项：

PCR反应中的延伸时间要根据具体反应而定，一般来说每分钟合成1000 bp左右。

C.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳反应结束后，用10 μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析，一般来说琼脂糖浓度为1 %，缓冲液为1XTAE。若试验成功，应出现一条目的带，至少目的带的亮度与其它非特异扩增带相比，差异显著。

注意事项

1. 引物：根据所需扩增片段，设计两条特异引物，设计引物的原理同常规PCR，引物的贮存浓度通常为10 μmol/L。
2. 模板：可以是cDNA基因组DNA或其它DNA。