简介

常规 PCR 反应可以扩增到 3〜4 kb 的 DNA 片段，而超过 5 kb 的 DNA 片段就已经很难扩增出来了。虽然有人可以扩增出 5〜15 kb 的 DNA 片段，但产量很低。造成常规 PCR 扩增长片段 DNA 效果不好的原因有以下几点：

① 常规 PCR 反应中应用的耐热 DNA 聚合酶（如酶）缺乏 3'→5' 核酸外切酶活性，不具备很好的校读功能，因而具有较高频率的错误碱基的掺入，不能有效扩增长片段 DNA；

② 较长的模板 DNA 容易形成高级结构，使 DNA 聚合酶难以与模板结合，也就实现不了其聚合功能；

③ 较长的模板 DNA 变性存在困难；

④ 缓冲液在 PCR 高温条件下可能会失去缓冲能力，造成模板 DNA 和产物 DNA 的损坏；

⑤ 二价阳离子在高温条件下也会促进 DNA 的降解。要想较好地扩增出长片段 DNA，必须解决上述 5 个问题。其中最为关键的是第 一个问题，其它问题可以通过调整反应条件给予解决。第一个问题的解决需要利用一种具有及时 切除错配碱基的酶。自然界中存在这样的酶，例如 Pfu、Vent、Deep Vent 等，它们具有 核酸外切酶活性，具有校读功能，但链延伸能力较弱，单独使用此酶也不能完成长片段 DNA 的扩增，需要和常规 PCR 中的 DNA 聚合酶联合使用。

1994 年，Barnes 等^[1] 首次将两种 DNA 聚合酶联合起来成功地扩增出 35 kb 的 DNA 片段。不久，Cheng 等^[2] 用相似的方法以 RDNA 为模板扩增出 42 kb 的片段和以人基因组 DNA 为模板扩增出 22 kb 的片段。由此也就真正形成了一套长片段 PCR（long PCR、long range PCR 或 long and accurate PCR）的技术方法。

原理

长片段 PCR 实验的基本原理是用两种 DNA 聚合酶进行反应，一种是用常规 PCR 反应中应用的耐热 DNA 聚 合酶（常用 Taq 酶），它具有很强的延伸能力，依赖此酶进行链的延伸。另一种是具有 3'→5'核酸外切酶活性的耐热 DNA 聚合酶（常用 Pfu 酶），它具有较好的校读功能，可以将错配的碱基切割下来重新利用第一种酶进行链的延伸。两种酶各有优缺点，充分利用第一种酶的延伸能力和第二种酶的校读功能，使两种酶在反应中相辅相成，完成长片段 DNA 的扩增。

应用

长片段 PCR 实验的常用应用领域如下：

（一）长片段 DNA 的克隆

由于真核生物的基因存在内含子和外显子，一般基因较长。常规 PCR 技术很难扩增全长， 而长片段 PCR 为扩增这样的基因提供了技术平台。由于能够扩增大到 20〜50 kb 的片段，将使从 cDNA 中分离完整的基因简便易行，从而不必费时地从基因组文库中筛选目的基因。有人用长片 段 PCR 克隆到了全长的 HLA-B 基因，同时获得了 HLA-B 的新的等位基因。Benkd 等人式将长 片段 PCR 和反向 PCR 融合在一起，结合杂交技术，成功地扩增到了包含鸡内生原病毒元件的长 片段 DNA。另外，用长片段 PCR 可以从未克隆的 mRNA 延伸产物的混合物中产生大的 cDNA 分子。大的基因组片段可以从复杂的基因组杂交细胞系和显微解剖或流式细胞仪分离的染色体区 段中得到。

通过对感染性克隆的反向遗传学操作，实现了对 RNA 病毒的基因操作，在深入阐明病毒基 因组结构与功能、构建新型病毒载体以及筛选疫苗候选株等方面有很好的应用前景。传统构建克 隆的方法涉及许多亚基因组片段的克隆与连接，非常繁琐费时，长片段 PCR 技术的发展使得一 次性获得病毒的基因组序列成为可能，因而大大简化了全长 cDNA 克隆的构建过程。为了了解来 源于病人不同组织的 HIV-1 突变体病毒在定向性运动和增殖动力学方面的差异，Dittmar 等［们用 长片段 PCR 从一个 HIV 患者外周血单核细胞、淋巴结、脾、脑和肺中扩增出 HIV 的全长 DNA， 并在其 5’端加了此种病人特异的长末端重复，从而构建成了具有繁殖能力的 HIV 病毒。通过对 这些重组病毒定向性运动（包括定向于外周血单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞）和增殖能力的 实验，发现这些重组病毒具有相似的定向性运动和增殖活力，淋巴结来源的重组病毒和非淋巴结 来源的重组病毒在定向性运动中没有差别。应用此技术已经成功构建了 SFV （cpz）、TBE、甲型 肝炎、柯萨奇病毒 B6 和 JE 等 RNA 病毒的全长 cDNA 克隆。另外，以 PCR 为基础的染色体步行 技术也因长片段 PCR 的出现得以更广泛地应用。

（二）基因组研究

在基因组多样性研究中，起关键作用的是染色体上多态标记的复合体 —— 单模标本。这种标 记对于绘制疾病相关基因以及分析基因敲除小鼠非常有用。有人用等位基因特异的长片段 PCR 扩增到了 CD4 的单模标本，发现两个分子标记是分开的：一个是双等位的 Alu 缺失，另一个是 多等位性的重复。

对扩增片段进行限制性酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism， RFLP）分析，是常用的基因检测方法，长片段 PCR 技术的发展增加了 RFLP 的应用范围及准确度，已应用于检测 mRNA 分子的突变、基因作图等研究。扩增 50 kb 的靶序列将给分析细菌人工染色体（BAC）克隆和 P1 来源的人工染色体（PAC）克隆以及小的酵母人工染色体带来很大的方便。Skiadas 等人建立了一种光学 PCR 技术，此技术是将长片段 PCR 和光学基因组作图结合起来而建成的。它可以对细菌人工染色体和大的基因组 DNA 分子进行限制性酶切图谱分析，从而对序列未知的基因组位点进行基因组作图。此技术的优点是快速、不需要克隆载体，会得到高 质量的物理图谱。

另外，长片段 PCR 技术可以用于微生物分型、基因型及准种分析等多个研究领域。炭疽芽胞类杆菌的基因组序列是极其保守的，很难用常规的方法检测到不同菌株之间的 DNA 差异。近来有人用长片段 PCR 方法建立了一种可以简单高效地检测不同菌株之间差异的方法。针对炭疽芽胞类杆菌 DNA 序列中的重复元件设计单一引物，可以扩增到 10 kb 左右的多个 DNA 片段。通过对多种菌株扩增这样的片段，就可比较出不同菌株中存在的片段多少和片段大小的差异，从而可以区分不同的菌株，并可确定不同的菌株的特征。

随着多种基因组序列的测序完成，长片段 PCR 将会更加发挥其优势，在功能基因组时代占据一定的位置。例如，长片段 PCR 分析一个群体中的大分子的限制性片段长度多态性；通过扩增包含不同数目和长度内含子的基因组 DNA 片段，可以弄清楚内含子/外显子的边界；分离位于已知序列旁边的未知序列，产生一系列大小不同的扩增产物，以方便填补物理图谱中未克隆的 DNA 间隙，获得紧密相连基因之间的次序和方向；扩增散布重复序列之间（或不同类重复单位之间）的 DNA 区域，有利于 DNA 片段的指纹分析以及毗连 DNA 片段的排序和定向；应用于定 向转座子介导的作图和测序，这是一种潜在的快速高效分析 100 kb 甚至更大片段的有力手段等。

（三）基因突变和基因表达的检测

长片段 PCR 技术在检测基因突变和基因缺失方面有十分广泛的应用。TSC2 基因的大片段突 变是造成常染色体显性遗传病结节性硬化症（TSC）的原因之一。对 TS 以 基因大片段基因突变 的常规检测方法是 Southern 杂交和原位荧光杂交，但这些方法具有需要 DNA 量大等缺点。用长 片段 PCR 只需要较少量的基因组 DNA，并且很容易证实突变位点的序列。Dabora 等人⑼用长片 段 PCR 检测到 6 个 TSC 病人中存在着不同的 DNA 缺失，缺失片段大小分别为 4.5 kb、39 kb、 34 kb、1.4 kb、1.3 kb 和 lO.l kb。这一方法的应用为 TSC 的诊断提供了更多的理论依据。在另一 常染色体遗传病一多囊肾中，PKDI 基因的突变可能是其发病的原因之一口。入当用长片段 PCR 扩增 24 个病人样品的 PKD1 基因时，发现了 7 种突变，其中有两个缺失（一个缺失 3 kb， 一个缺失 28 bp）， 一个单碱基插入突变和 4 个核昔酸替代。因此，长片段 PCR 技术为探测长序列 复杂基因的突变提供了可能，从而为检测致病基因的突变和缺失带来了方便。另外，有人已经用 长片段 PCR 技术将病毒基因组和线粒体基因组扩增出来，以便寻找基因突变和基因缺失。

在检测基因重排和基因融合方面，长片段 PCR 可扩增含有可扩展的三联体重复序列的基因如 亨廷顿（Huntington）病基因，为亨廷顿式病进行症状前诊断成为可能。Friedreich 共济失调症病人的 FRDA 基因内含子的扩增产物显示，GAA 三联体扩展很可能与发病相关。并且，用长片段 PCR 技术研究表明，肌强直性营养不良病与亨廷顿病和 Friedreich 共济失调症有相似的发病模式。长片段 PCR 用来探测染色体转位位点的基因重排对临床诊断血液性恶性肿瘤非常有帮助。在 mRNA 水平对这些疾病的诊断通常要依赖于 RT-PCR 和 Northern 分析；在 DNA 水平，由于基因重排造成的基因跨度远远超过了传统 PCR 的扩增范围，用长片段 PCR 可以解决这个问题。近来有人口用长片段 PCR 技术建立了一套基于基因组 PCR 的探测系统，成功证实了 5 号染色体的 NPM 基因与 2 号 染色体 ALK 基因的融合，融合后的基因会产生一种不可思议的转录体（NPM 的 N 端序列与 ALK C 端序列的融合转录体）。用长片段 PCR 对 11 个肿瘤样品中两个基因融合位点的 DNA 扩增发现， NPM 和 ALK 基因融合的位点是唯一的，并且在两个染色体上有相同的内含子参与其同源重组过 程。也有人在 B 细胞肿瘤中检测到了在染色体转位处有多种基因融合。

另外，在检测特异表达基因方面，将 RT-PCR 和长片段 PCR 结合起来，可以扩大对稀有转录体和组织特异表达基因的检测范围。有人用此技术扩增到了 13。 5 kb 的差异 cDNA0 在基因打靶研究中，寻找到一种简单高效的筛选阳性克隆的方法是至关重要的。Lay 等人切用长片段 PCR 成功地建立了这样一种方法。首先从基因组文库中用长片段 PCR 扩增出目标基因及其两侧特异的序列，用此序列设计引物，再次用长片段 PCR 检测中靶情况。他们对缩胆囊素和胃泌激素基因打靶的胚胎干（ES）细胞的实验表明，此方法对于快速准确地鉴定胚胎干细胞中等位基因位点的同源重组情况是非常有用的。

操作方法

长片段PCR实验

简介

常规 PCR 反应可以扩增到 3〜4 kb 的 DNA 片段，而超过 5 kb 的 DNA 片段就已经很难扩增出来了。虽然有人可以扩增出 5〜15 kb 的 DNA 片段，但产量很低。造成常规 PCR 扩增长片段 DNA 效果不好的原因有以下几点：

① 常规 PCR 反应中应用的耐热 DNA 聚合酶（如酶）缺乏 3'→5' 核酸外切酶活性，不具备很好的校读功能，因而具有较高频率的错误碱基的掺入，不能有效扩增长片段 DNA；

② 较长的模板 DNA 容易形成高级结构，使 DNA 聚合酶难以与模板结合，也就实现不了其聚合功能；

③ 较长的模板 DNA 变性存在困难；

④ 缓冲液在 PCR 高温条件下可能会失去缓冲能力，造成模板 DNA 和产物 DNA 的损坏；

⑤ 二价阳离子在高温条件下也会促进 DNA 的降解。要想较好地扩增出长片段 DNA，必须解决上述 5 个问题。其中最为关键的是第 一个问题，其它问题可以通过调整反应条件给予解决。第一个问题的解决需要利用一种具有及时 切除错配碱基的酶。自然界中存在这样的酶，例如 Pfu、Vent、Deep Vent 等，它们具有 核酸外切酶活性，具有校读功能，但链延伸能力较弱，单独使用此酶也不能完成长片段 DNA 的扩增，需要和常规 PCR 中的 DNA 聚合酶联合使用。

1994 年，Barnes 等^[1] 首次将两种 DNA 聚合酶联合起来成功地扩增出 35 kb 的 DNA 片段。不久，Cheng 等^[2] 用相似的方法以 RDNA 为模板扩增出 42 kb 的片段和以人基因组 DNA 为模板扩增出 22 kb 的片段。由此也就真正形成了一套长片段 PCR（long PCR、long range PCR 或 long and accurate PCR）的技术方法。

原理

长片段 PCR 实验的基本原理是用两种 DNA 聚合酶进行反应，一种是用常规 PCR 反应中应用的耐热 DNA 聚 合酶（常用 Taq 酶），它具有很强的延伸能力，依赖此酶进行链的延伸。另一种是具有 3'→5'核酸外切酶活性的耐热 DNA 聚合酶（常用 Pfu 酶），它具有较好的校读功能，可以将错配的碱基切割下来重新利用第一种酶进行链的延伸。两种酶各有优缺点，充分利用第一种酶的延伸能力和第二种酶的校读功能，使两种酶在反应中相辅相成，完成长片段 DNA 的扩增。

材料与仪器

器材：0.5ml 离心管、PCR 仪、移液器和微量加样器的 tip。

试剂：

① 10 X PCR 缓冲液（500 mmol/L Tris-Cl （pH9.0）， 160 mmol/L 硫酸铵，25 mmol/L MgCl2，1.5mg/ml 牛血清白蛋白）

② dNTPs： 20 mmol/L， pH8.0

③ 正向引物：20 μmol/L

④ 反向引物：20 μmol/L

⑤ 热稳定 DNA 聚合酶混合液：0.187 U Pfu （Stratagene）和 33.7 U Klentaql （AB Pep¬tides）。在长片段 PCR 反应中使用效果较好的聚合酶组合见表 10-1

⑥ TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl （pH8.0）， l mmol/L Na2EDTA

⑦ 10 X TBE 缓冲液：90 mmol/L Tris， 89 mmol/L 硼酸（pH8.3） ， 2.5 mmol/L EDTA

⑧ 琼脂糖凝胶电泳试剂

步骤

长片段 PCR 实验的基本过程可分为如下几步：

A 引物设计

引物设计的原则应遵守常规 PCR 引物设计原则，即避免形成二级结构及引物二聚体等。另外，在长片段 PCR 中引物 3' 末端核昔酸的特异性对长片段扩增尤为重要，应与模板严格配对，且要注意两引物的 3' 末端不能互补。引物长度通常比常规 PCR 的引物稍长些，在 30〜35 个碱基，过长不会增加扩增的效率，过短会减少扩增的特异性。两条引物的解链温度趋向相等是尤其 重要的。如果两条引物的解链温度超过 1 ℃，可能会造成错误引导以及一条链的优势扩增等问 题。用于长片段 PCR 的引物用全自动 DNA 合成仪合成后，一般不需要进一步纯化。然而，如果 寡核苷酸引物经商品化的树脂进行柱层析纯化或者经变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，纯化后的 引物用于扩增低丰度的 mRNA 时常常会更有效。

B 模板的制备

长片段 PCR 对于多种类型的模板都能有效扩增，例如重组 BAC、PAC、黏粒、A 噬菌体克 隆、高分子量基因组 DNA 和由 RNA 反转录得到的 cDNA0 DNA 模板的平均长度至少应该是预 期的 PCR 扩增产物长度的 3 倍以上。模板 DNA 应该尽可能有较高的纯度。作为长片段 PCR 的 DNA 模板的纯化制备，最好的方法是使用超速离心机进行 CsCl 平衡密度梯度离心，然后用 TE （pH8.0）缓冲液进行透析。也可用磁珠吸附长片段的 DNA 得到较纯的模板。已被轻微损伤的模板，应用大肠杆菌核酸外切酶 m 处理，能够部分消除损伤模板对扩增反应的影响，可大大提高扩增效果。

C 反应体系

按下列次序将各种试剂加入到 0.5 ml 的离心管中：

① 5 μL 10 X PCR 缓冲液；

② 5 μL 20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液；

③ 1 μL 20 μmol/L 正向引物；

④ 1 μL 20 μmol/L 反向引物；

⑤ 0.2 μL 热稳定 DNA 聚合酶混合液；

⑥ 100 pg〜300 ng DNA 模板。

加 HQ 补足至 50μL

如果 PCR 仪没有配置加热盖，PCR 反应混合液的上层加入矿物油或石蜡油约 80 μL，以防止液体挥发。PCR 反应结束后，可以用 150 μL 氯仿抽提去除。

D 反应参数

93〜94 ℃ 2 min

92〜97 ℃ 15 s〜I min， 60〜67 ℃ 1 min， 68 ℃ 5〜20 min， 25~30 循环

68 ℃ 7 min

一般来讲，常规三阶段热循环法可以实现长片段的扩增。但是，如果引物大于 30 个碱基， 退火温度在 65〜70 ℃ 之间，釆用两阶段热循环法扩增效果更好。复性温度的设置依赖于寡核昔 酸引物的熔解温度（即解链温度）。因为用于长片段 PCR 的引物长度一般是 27〜30 bp，因此用于长片段 PCR 引物的熔解温度比一般 PCR 引物的熔解温度高。聚合反应的时间应根据靶基因的长度按每分钟聚合 1000 bp 的速率来确定。聚合时间过于延长不能改善扩增产物的特异性或产量。变性的温度和时间是影响长片段扩增非常重要的因素，高温可以损伤模板 DNA，使得 DNA 聚合酶终止合成。减少模板损伤常采用的方法是：釆用尽量低的变性温度及尽量短的变性时间。延伸时间根据扩增片断的长度和所选用酶的特点而定，时间不能过长，以免形成非特异扩增。后期反应中每次循环递增延伸时间的办法有利于长片段的扩增。热启动可以减少非特异扩增。对于难于优化的模板来说，用每循环降低退火温度的降落 PCR（touch down PCR）方法，以实现对反应条件的自动调试，有时会得到理想的扩增结果。

E 扩增产物的检测

目前最常用的检测方法是用琼脂糖凝胶电泳再以适当大小的 DNA Marker 来分析扩增结果。 在许多情况下，扩增产物太少以至于用常规的漠化乙锭染色不能检测到目的条带。在这种情况 下，用 SYBR 金颗粒对凝胶上的 DNA 样品进行染色或转移凝胶上的 DNA 样品到尼龙或硝酸纤 维素滤膜上用探针进行 Southern 杂交予以确证。

注意事项

1 对于不同来源的模板 DNA，要进行具有针对性的严格优化。在某些情况下，一些非特异片段会干扰长片段 PCR 扩增，可以减少酶量和降低盐浓度来增加 PCR 产物的特异性。对于有些模板，其二级结构过于复杂或不易得到较高的浓度，一次性实现长片段扩增非常困难。釆用融合 PCR 方法就简单多了。先分段扩出、相互部分重叠、然后将覆盖整个长片断基因组的两段或几段 PCR 产物进行融合反应，以形成全长 DNA，再以此为模板进行长片段 PCR，可以成功实现长片断的扩增。模板 DNA 的用量在 l00 pg〜2 μg 之间，模板量太少，扩增产物往往检测不到，模板量太多，扩增产物的特异性显著降低。最好是针对模板 DNA 进行预试验，以确定最佳模板量。某些轻微损伤的模板用核酸外切酶 Ⅲ 处理的原因是因为核酸外切酶 Ⅲ 除了具有 3’→5’外切酶活性外，还具有对无嗦吟、无嚅嚏碱基的 DNA 部位显示特异性内切酶活性，对 3’末端无羟基的 DNA 显示了 3’磷酸酶活性以及 RNaseH 活性，降解有缺口的 DNA，保证了模 板的完整性。

2 100 mmol/L KCl 可以替代 10 X PCR 缓冲液中的硫酸镂。小牛血清白蛋白可以被多种其它 添加剂所替代。这些添加剂的理论作用模式及作用的最终浓度见表 10-2。

这些添加剂能够促进长片段的扩增，可能是通过增加聚合酶的稳定性、降低解链温度以及减 少模板链损伤而发挥作用。因为在高温情况下长片段 DNA 模板极易发生脱嗦吟作用和脱氨基作 用，甘油和二甲基亚砚等添加剂可以有效地减缓变性的温度和时间，最小程度地减少 DNA 的损 伤。并且在某些情况下，同时添加几种添加剂比只加入一种更有效。添加剂浓度过高时会抑制酶 的活性，因此也要对其应用浓度进行优化。

3 在低 pH 值的环境下，长片段模板 DNA 容易发生脱噤吟作用而受到损伤，因此，缓冲液 最好釆用比 Tris-HCl 的缓冲能力更强的三（羟甲基）甘氨酸（tricine），这样 pH 值才会在高温 环境中变化较小，减少对模板 DNA 的损伤。

4 Mg2⁺ 浓度一般要比常规 PCR 反应中的浓度高，约在 2〜6 mmol/L。Mg2⁺ 是 DNA 聚合酶 活性依赖因子，不仅影响聚合酶的活性和忠实性，也会影响引物的退火、产物的特异性和二聚体 的形成等。Mg2⁺ 浓度过低会影响到酶的活性，过高则会降低酶的忠实性和引起非特异扩增。但 是目前在长片段 PCR 反应中，还没有确定一个最佳的 Mg2⁺ 浓度。通常解决的方法是，在能够保 证扩增产率及特异性的前提下，选用尽可能低的 Mg2⁺ 浓度，以最大限度提高聚合酶的保真性。

5 在长片段 PCR 反应中，聚合酶的保真性至关重要。要根据各种 DNA 聚合酶的特性选择用酶。各种 DNA 聚合酶的特点、要求条件以及特性评价见表 10-3。

6 长片段 PCR 反应用管应该使用薄壁管，反应体积也不宜过大，以免影响热传导效率。不 同的 PCR 仪对反应也有影响，相同的扩增条件在不同的热循环仪上会得到不同的实验结果，可 能是由不同 PCR 仪温度升降的速率不同所致。

7 PCR 仪可以是 Perkin-Elmer9600 或 9700，也可以是 Eppendorf 公司的 Master cycler，也 可以是 MJ Research 公司的 PTC100。