简介
PCR 芯片是在硅片或玻璃片等基片材料上加工生成一系列的微管道、微反应室等空间结构，并整合微阀、微加热器、微感应器等控制结构，利用芯片集成度高和比表面积大的特性，实现芯片上的快速 PCR 扩增。
原理
PCR 芯片是在硅片或玻璃片等基片材料上加工生成一系列的微管道、微反应室等空间结构，并整合微阀、微加热器、微感应器等控制结构，利用芯片集成度高和比表面积大的特性，实现芯片上的快速 PCR 扩增，它具有反应体积小、加热速度快、热循环时间短、高通量等特点。
应用
PCR 芯片适用于各种各样的研究目的，包括人类、动物和植物等各种生物的多种基因的基因重排、基因突变和基 因缺失的鉴定等，在临床肿瘤和白血病的诊断、人类基因组分析、基因多态性和疾病易感性鉴定、遗 传性疾病的基因诊断、动物和植物基因变异筛选、各种病原微生物鉴定等多方面有广泛应用前景。
操作方法
PCR 芯片的制作
简介
PCR 芯片的制作，是在硅片或玻璃片等基片材料上加工生成一系列的微管道、微反应室等空间结构，并整合微阀、微加热器、微感应器等控 制结构，利用芯片集成度高和比表面积大的特性，实现芯片上的快速 PCR 扩增。
原理
基于芯片的 PCR 技术主要有两种模式：一种是试剂在温度循环变化的管道区间中连续流动实现 PCR 扩增，这种芯片被称为连续流动式 PCR 芯片（continuous-flow PCR chip）；另一种是试剂不动，而芯片微反应池（腔）的温度迅速循环变化实现 PCR 扩增，这种芯片被称为微腔式 PCR 芯片（micro chamber PCR chip）。前一种芯片的反应速度要比后一种快，而后一种芯片更容易实现集成化。
连续流动式 PCR 芯片使试剂在微管道中沿三个固定的温度区连续流动，每流过三个温度区就完成一次温度循环，也就完成了一次扩增。连续流过不同温度区的循环次数决定了 PCR 产物 的放大倍数。连续流动式 PCR 芯片的反应速度明显比微腔式 PCR 芯片的反应速度快，一般为几 分钟到 20 min, 一个 20 个循环的 PCR 最快可在 1. 5 min 内完成。连续流动式 PCR 芯片的缺点是 集成度难以提高，其体积不能缩小的原因是试剂在三个加热区的停留时间必须足够长，所以在流速固定的情况下就要求液体流动的长度足够长。
微腔式 PCR 芯片又叫微 PCR 芯片（micro PCR chip）, 是用微电子机械系统（MEMS）加工技术在芯片上制作一个个微小的腔体储存反应液，在外部或内部对它进行加热和降温来实现温度 循环。由于腔体的体积非常小（几个微升），因此热容非常小，可以实现较快的加热和制冷，有利于制作集成化的装置。
材料与仪器
器材：
光刻机
试剂：
①硅片
②玻璃
③绝缘材料
④二氧化硅
⑤氮化硅
⑥金属材料：铭、金等
步骤
PCR 芯片制作的基本过程可分为如下几步：
①在芯片背面制作制冷（加热）层和钳电阻温度传感器；
②正面进行反应池刻蚀；
③以玻璃盖封装。
制备反应池的材料通常选择双面抛光的硅单晶片，制作过程的具体工艺流程：
①清洗硅片； ②硅片氧化；③沉积氮化硅层；④光刻下层电极；⑤溅射下层金属电极；⑥光刻钳电阻图形； ⑦溅射钳；⑧光刻；⑨电子束蒸发 N 型材料；⑩剥离；⑪光刻；⑫电子束蒸发 P 型材料；⑬剥离；⑭光刻绝缘层；⑮溅射二氧化硅；⑯光刻上层电极；⑰溅射上层金属电极；⑱光刻正面反应室窗口；⑲离子刻蚀氮化硅；⑳湿法腐蚀；㉑表面封装。
其中，金属电极采用溅射的方法制作，分别溅射：铭 5nm, 金 200nm, 钳 20nm。铅为氮化硅与金之间的过渡层，钳为金与热电材料之间的过渡层，防止金的扩散。热电薄膜釆用电子束蒸发的方法制作，膜厚为 400nm。为保证上层电极板的牢固,. 并防止上下两层电极板的短路，在两层电极板之间利用溅射的方法加入二氧化硅绝缘层，厚度为 600nmo
纳升高通量 PCR
简介
纳升高通量 PCR 是指将高通量的芯片技术与 PCR 技术结合在一起产生的一种新的方法，商用的 TaqMan® OpenArray™系统已将反应体系降至纳升，这对稀少样品的检测极为有利，并且在一张芯片上可以完成多达 3072 个反应，可以进行终点定量，也可以进行实时定量。
原理
TaqMan® OpenArray™系统的基本原理是是在一块薄的不锈钢电极板（25 mmX75 mmX0. 3 mm）上以 48 个子阵，每个子阵 64 个通 孔的形式排列 3072 个通孔，每个子阵的间距为 4.5 mm, 与 384 孔板相同。每个通孔的直径和深度均为 300/m, 可容纳 33nl 反应体系。芯片表面经过专利的疏水处理，而通孔内壁是亲水且生物兼容的。液体通过表面张 力留于芯片通孔内，试验所需的引物被预先 脱水固化于通孔内壁。使用时将 TaqMan® OpenArray 384 孔样品平板中的 DNA 样品与 PCR master mix 混合。用自动上样仪将样品混合物加样到 TaqMan® OpenArra 严纳升高通量 PCR 芯片中。将芯片插入装满浸液的封箱工作站中，并用封箱胶水密封。在对应的热循环仪上进行循环，用 NT 成像仪成像，并分析数据。图解示意如下。
用途
纳升高通量 PCR 芯片所需样品量小，仅 33nl, 但同批处理的样品数量大，可达 3072 个样 品，适用于大样本而且量稀少的样品的处理。另外，该芯片除了可以对 DNA 样品进行处理，还 可对 RNA 样品进行定量 PCR 口⑶。另外，该方法在菌落的大规模筛选中也可应用⑷。
材料与仪器
器材：
热循环仪（推荐 MJ lower PTC-200）； NT 成像仪（Bio Eove Inc.）； TaqMan® OpenArrayW 自动上样仪。
试剂：
TaqMan® OpenArray™平板芯片；TaqMan® OpenArray™ 384 孔样品平板（内含待检样 品）；PCR Master Mix 含 0. 5% 甘油，1 % Pluronic F38（BASF）和 50ng/ul BSA；封箱胶水（环氧树脂）；浸液。
步骤
以 48 个血液样本的 SNP（single nucleotide polymorphism, 单核苷酸多态现象）分型为例，纳升高通量 PCR 的基本过程可分为如下几步：
①利用试剂盒 QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA）提取分离血液样本（384 孔板中）的 DNA, -20℃ 冻存或将微平板置于冰上。
②以唯一的数字或字母命名微平板的每一个孔，使 SNP 分型软件可以追踪每一个从微平板转移至纳升平板的样品。
③将含有 DNA 样品的微平板室温解冻，1000r/min 离心 1 min, 冰上放置。
④吸取 211ul PCR master mix（10% 多余量）。
⑤在微平板的 48 个孔中，每个孔加入 4ul PCR master mixD
⑥每个 DNA 样品吸取分别与 4ul PCR master mix 吹吸混匀。
⑦用铝箔盖住含有 DNA 样品的微平板，1000r/min 离心 1 min 以去除气泡。冰上使样品冷却。
⑧用钳状骨针铝箔，暴露要转移至纳升高通量 PCR 芯片的 48 个样品，自动上样仪将样品加至芯片透孔中。
⑨将芯片插入装满浸液（一种与 PCR 反应体系不混溶的全氟化液体）的封箱工作站中，以 UV 照射环氧树脂密封，防止反应体系在热循环中挥发。
⑩将密封好的芯片放入热循环仪，设定程序如下：91°C 预变性 10 min, 然后以 51°C 23s、 53. 5°C 30s. 54.5°C13s、97°C 22s、92°C 7s 进行 50 个循环。循环结束后保持在 20°C 直至芯片被 成像处理。
⑪用 NT 成像仪成像，并分析数据。
注意事项
①PCR master mix 的体积应多余 10% , 防止吸头的误差。
②用 OpenArray 自动上样仪将样品混合物上样到 TaqMan® 0 卩 2 話口汕即平板芯片中时, 芯片与吸头末端形成液体三明治结构。但是液体不会沾湿芯 片表面，因为芯片的表面经过疏水化处理，液体会迅速、 精确地进入每一个经过亲水化处理的透孔。
③在 SNP 分型中，DNA 的量和质量会影响准确率。 如图 8-6 所示，在三组试验中（分别用三角、圆圈和方框 代表），DNA 的质量不同，每个反应中 DNA 的浓度在 0.01〜Ing 之间，可以看出不同浓度的准确率各有不同。 但是有些反应，如三角代表的一组，在 DNA 的浓度低至 0. Olng 时准确率仍高达 90%；而有些反应，如方框代表的 一组，在 DNA 的浓度达到 0. 15ng 时，准确率才能达到 90%, 而小于 0. 15ng 时准确率就会迅速下降，在 0. Olng 时准确率不到 70%。这种准确率的改变为杂合子和纯合子 的分离增加了难度。
④TaqMan 试验的再设计也会增加纳升平板芯片的效果。图 8-7 所示为 TaqMan SNP 分型的 两次试验，图（b）中的试验与图（a）相比在探针的 5』末端添加了一个单核苷酸。这个改动大大提 高了基因分型的效果。
30000r 30000r
|
0 . . — |
o' * ■ 1— |
|
||
|
0 4000 8000 12000 |
0 |
4000 |
8000 |
12000 |
|
' VIC荧光值 |
VIC荧光值 |
|||
| （a） | （b） |
图 8-7 通过引物探针的再设计增加基因分型的有效性
⑤引物可以使用软件 Primer3 设计或在引物库中筛选，引物的退火温度应在 60〜65C, 采 用退火温度最接近的引物对。引物序列的长度应在 18〜25 个核苷酸，（G+C）含量在 30%〜 60%。每一对引物都经过磷酸化处理，通过离子键与芯片内壁表面结合，直到 PCR 反应的开始。
微流控 PCR
简介
微流控 PCR（micro flow-through PCR）是 Martin 等人在 1998 年发明的一种新的流动扩增 DNA 的技术孔 作为第三代 PCR 技术，它的反应体系更小、所需时间更短，而扩增效率并不亚于常规 PCR 和微室 PCR（micro chamber PCR）0 在昂贵稀少样本的检测中有广泛的应用。
原理
微流控 PCR 芯片的实验原理是在其芯片中有 A、B、C 三个恒温区，分别用于 PCR 的变性、复性和延伸，三个恒温区之间有绝缘材料防止热扩散。在芯片上蚀刻微通道，PCR 反应液和不混溶的载液在微通道中连续流动，顺次循环通过这三个恒温区完成扩增反应。微通道的蚀刻模式决定了反应液通过各温度区的时间比以及循环数，微通道的长度以及样品的流速决定了反应时间的长短。两个参数（U 和 D）用于描述样品和试剂的温度均一性和偏差。反应结束在出口收 集反应液，电泳检测扩增效率，或在反应液中加入荧光染料，以光度计直接检测。
用途
微流控 PCR 除了可以处理 DNA 样品之外，还可以对 RNA 样品进行反转录 PCR。因此，微流控 PCR 可广泛应用于病毒感染的 快速分子检测、毒物筛查等。如不对称螺旋管芯片的发明者 Hartung 等人就釆用微流控 RT- PCR 检测感染 HPV（人乳头瘤病毒）的 SiHa 细胞，结果发现灵敏度很高，阳性细胞的浓度低至每微升 5 个细胞时都可以检测到病毒的 mRNA。
材料与仪器
器材：
加样注射泵；扩增柱（不对称螺旋管芯片）；Teflon FEP 连接管。
试剂：
模板 DNA； dNTPs（各 10 mmol/L）； PCR 缓冲液（10X）；引物；BSA； MgCl2 ； T 纣聚合 酶；SYBR green（1 : 10000 稀释）（结果以光度计检测时加入）；水；载液。
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