简介

全基因组 PCR，又称全基因组扩增 (whole genome amplification, WGA)，是一种对全部基因组序列进行非选择性 扩增的技术，主要目的是在如实反映基因组全貌的基础上最大限度地增加 DNA 的量，在没有序 列倾向性的前提条件下对微量组织、单个细胞的整个基因组 DNA 进行扩增，为后续的多基因、 多位点分析及基因组的全面研究提供足量的 DNA 模板。目前，用于全基因组 PCR 的方法主要有 4 种：简并寡核苷酸引物 PCR、引物延伸预扩增 PCR、连接物 PCR、多重替代扩增等。

原理

根据实验方法不同，对应的原理也有所不同：

简并寡核苷酸引物 PCR 的基本原理是
DOP-PCR 用一条部分随机的引物对模板基因组 DNA 进行两步 PCR 扩增。简并寡核苷酸引 物的序列为 5』-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3』, 3』端的 ATGTGG 序列是基因组 DNA 中 分布频率极高的短序列，在第一步低温退火时起引导作用，也就是说扩增的起始位点由这 6 个 特异的碱基决定，退火有一定序列倾向性。这种在靶基因特异位点开始的扩增优于随机位点开 始的扩增，可以降低扩增结果的复杂程度。中间 6 个简并碱基可以生成 46 种不同的序列，简并碱基中 1 个或多个碱基与 3』端特异碱基一起在退火过程和模板 DNA 同时复性，加固引物与 模板 DNA 的结合作用；5'端的序列则是用于末端修饰，包括用于克隆的酶切位点。扩增反应 分两步进行：最初几个循环 (3〜5 个) 在低退火温度 (如 30°C) 下退火，使引物在模板 DNA 全长范围内随机退火并对模板 DNA 进行低严紧扩增；第二步则将退火温度升高至 62°C 特异性 退火，如同常规 PCR 进行 25〜35 个循环，对第一步低严紧扩增产物进行放大。DOP-PCR 扩增 效率高，扩增片段的长度大小在 300bp-1.7kb, 平均 500bp 左右，DOP-PCR 的扩增效率主要 依赖于引物的浓度和聚合酶的活性。在低退火温度条件下，引物能与多个基因组位点 (人类基 因组可以达到 106) 结合，扩增产物几乎覆盖全部基因组，是 WGA 中最具代表性的方法之一。

引物延伸预扩增 PCR 的基本原理是
PEP-PCR 以随机组成的 15 个碱基寡核昔酸为引物，这种引物在理论上有 415 种排列顺序， 在低温 (37°C) 下随机与基因组 DNA 的大量位点退火，55°C 延伸，并且每个循环的退火温度都 是由 37°C 连续升温至 55°C，确保不同组成的引物与尽可能多的基因组序列退火，随机扩增整个 基因组 DNA。PEP-PCR 可以使基因组 DNA 放大几十倍。扩增产物经过特异基因位点的巢式或 半巢式 PCR 鉴定扩增效率和保真度。PEP-PCR 的扩增效率低于 DOP-PCR, 无法用常规的方法 检测产物的片段大小，但它的覆盖率却高于 DOP-PCR。因而 DOP-PCR 用于 CGH 可以获得满意 的结果，而 PEP-PCR 的 CGH 信号非常微弱；但是，改良的 PEP-PCR 可用单个肿瘤细胞进行微 卫星的分析。

连接物 PCR 的基本原理是
由于适于 PCR 扩增和 CGH 分析的 DNA 片段最适长度为 0. 2~2.0kb, 因此将基因组 DNA 用识别四位点的限制性内切酶 (如 MseI , 识别 TTAA) 酶切，产生 100〜1500bp 的 DNA 片段， 并在片段的两端连接特定性的 DNA 序列 (adaptor), 并以与该序列互补的 DNA 序列作为引物扩 增修饰的 DNA 片段，从而达到扩增整个基因组的目的。

多重替代扩增的基本原理是
链替代扩增 (strand displacement amplification, SDA) 是应用滚环扩增 (rolling cycle amplification, RCA) 的方法，既可用于信号的放大也可用于目的基因的扩增。Dean F. 等基于链替代 扩增方法原理创建了 MDA, 用于扩增全基因组 (见图 13-11)。该方法利用φ29DNA 聚合酶和随 机六聚体引物对人基因组进行扩增，可以直接从生物样品如全血、组织培养细胞中扩增，在常温 等温下扩增，避免了高温下 DNA 降解对扩增产物质量的影响。φ29DNA 聚合酶具有的主要特性 如下：①具有非常高的向前延伸的活性，且与模板紧密结合，能高效合成 DNA, 每一次结合到 DNA 链上可以引导 70000 个碱基掺入。这样随机起始合成有代表性的基因组 DNA 不会受序列本 身的碱基组成、短的串联重复序列或二级结构影响，使得在存在复杂的一级和二级结构的情况下 PCR 反应仍能顺利进行高效的 DNA 合成，最大限度减少了链转换和二级结构形成。②支持链取 代 DNA 合成。下游的互补链被酶取代出来成为单链，并可以作为下一步随机六碱基引物的起始 模板。③φ29DNA 聚合酶 3'→ 5'外切酶活性，其有高保真纠错功能，报道的错误率仅为 10-5〜 10-6, 约比 Tg 聚合酶低 100 倍。 所以与 DOP-PCR 和 PEP-PCR 比较，MDA 无论是扩增的效 率，还是扩增的可信度都明显优于 DOP-PCR 和 PEP-PCR, 能均匀扩增全基因组，而没有明显的 偏移；MDA 可以从 1〜10 个拷贝的基因组 DNA 扩增出 20〜30 μg 的产物，DNA 产物的平均长度 大于 10kb。 MDA 具有的这些优点使 MDA 适合多方面的应用，包括定量 PCR、单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 基因分型、Southern blot 分析及染色体图谱的绘制等。 MDA 不需要从微生物样品中分离基因组 DNA 就可直接进行扩增，并可用于 DNA 序列分析。因 此，MDA 是扩增难以分离培养的生物样品基因组 DNA 的首选方法；MDA 也可用于从可疑感染 的组织中扩增微生物基因组 DNA, 如关节炎。

应用

全基因组 PCR的常用应用领域如下：

WGA 对全基因组进行扩增从而为遗传研究提供足够的 DNA, 它的应用和发展使得利用单个 细胞和极微量的 DNA 模板进行多方面的遗传学研究成为可能，WGA 作为强有力的工具在建立 DNA 文库、基因分型、植入前遗传学诊断、产前诊断、显微切割诊断、肿瘤遗传学研究、微生 物多样性、古生物学、生物恐怖、基因组测定和法医学等方面得到广泛应用。

1. 建立 DNA 文库

Alu-PCR. LA-PCR、T-PCR 以及 DOP-PCR 的扩增产物最初主要用于建立重组 DNA 文库， 也为整条染色体分析和特异染色体分析提供 FISH 探针⑵］。

2. 单核昔酸多态性分析（SNP）和 STR 基因型检测

人类基因组中最常见的变异形式是单核昔酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）, SNP 在基因组中大量存在、广泛分布，与家族研究、肿瘤异质性研究等相结合，可作为鉴定致 病基因的遗传标志。因此，它也是诊断肿瘤、糖尿病、精神病等人类疾病的重要指标。但是目前 主要的障碍是没有有效的方法对成百上千的遗传标记进行大规模遗传定位，发展大规模、快速、 低值高效的鉴定 SNP 的技术是人类基因组研究发展的需要。普通 PCR 需要对含有 SNP 的位点进 行单独的扩增，人类基因组估计有 500000 个致病基因，每个反应需要 10ng DNA, 那么完成 500000 个 SNP 的筛查需要 5 mgDNA, 其来源将是非常困难。虽然多重 PCR 可以提高 SNP 基因 分型的效率，但是不能适应更多位点的研究需要。克服这些缺点的途径就是对全基因组扩增。用 基因组 DNA 的 DCPPCR 扩增产物作为模板进行 SNP 基因分型，可以获得与以基因组 DNA 作 为模板进行的基因型分析一致的结果。用 DOP-PCR 扩增产物进行 SNP 分型具有以下特点：第 一，整个试验用一条引物，大大降低成本；第二，扩增效率高，通过对人、小鼠等用同一条 DOP-PCR 引物可以使分布于染色体上的 SNP 位点放大，有足够的 DOP-PCR 产物作为靶 DNA 直接用于 SNP 基因分型，并能得到足够好的结果；第三，增加 3』端的特异性核昔酸序列的长度， 提高 DOP-PCR 扩增的特异性，DOP-PCR 随机扩增的序列可以精确定位于基因组序列，而且用 特定的简并引物可以预期哪些 DNA 序列得到扩增（也就是说预期 SNP 位点得到扩增）。虽然人 类基因组测序已完成，有助于全基因组扩增引物的设计，改善全基因组扩增的策略，使全基因组 的大规模分析更有效、更直接；但是 DOP-PCR 也可以使大量不含 SNP 位点的序列扩增，而这些 序列在基因分型过程中产生干扰，给特异的基因分型带来困难；即使是根据已知基因组序列设计 引物，DOP-PCR 扩增的序列预测仍然不一定准确；由于扩增效率的不同和简并引物的多态性, 某些预计的片段有可能不被扩增。因此某一特定的 DOP-PCR 扩增产物中并不包含所有的所需的 SNP 多态性位点，但可能含有并非所预计的 SNP 位点被扩增。当然，对某些未知序列的生物来 说，DOP PCR 也不失为一种获得一系列 SNP 资料的有效方法。
DOP-PCR 在 SNP 分析中应用的另一潜在优势是 DOP-PCR 扩增产物可用于大部分 SNP 分析 平台。这些分析平台敏感性高，可独立对存在于扩增产物中的数百个 SNP 位点进行基因型分析, 因而，用 DOP-PCR 扩增的产物就可完成对整个基因组的 SNP 扫描 ［对于 STR 研究，Peter 等列对 5 cm 范围内的 768 个 STR 标记进行分析，发现利用 MDA 进 行 DNA 基因型检出准确率与对照 DNA 只相差 1.5%o 而且对杂合性等位基因的扩增无明显倾向 性，也无重复序列的插入或缺失。在所有的标记中，扩增的误差主要集中于其中 34 个位点，这 可能是由于这些位点的扩增效率较低或者①29DNA 聚合酶的保真性下降。因此，在进行 STR 分 析时，应该注意这类标记。

3. 肿瘤遗传学研究

分析正常组织与良性、恶性肿瘤在微卫星多态性、杂合性缺失、点突变及基因重组、染色体 异常等方面的遗传信息，有助于追溯肿瘤细胞起源、发现肿瘤细胞杂合性缺失、基因突变及重组 等异常。WGA 可利用流式细胞仪、组织显微切割、激光组织显微切割分离的肿瘤细胞的基因组为模板，经过扩增获得足量的含有全部基因组信息的核酸序列，使多方面的遗传学研究成 为可能。由于 WGA 可以提高肿瘤细胞杂合性缺失分析的敏感性，因此可以利用肿瘤病人的尿、 痰等混杂有肿瘤细胞和正常细胞的临床标本开展无创性诊断 e，h，b8〜3%

4. 产前诊断

通过 WGA 不仅可对产前羊水细胞和绒毛膜细胞实现多基因位点的分析，而且也可对母血中 胎儿细胞进行细胞遗传学诊断。如对母血中胎儿有核红细胞进行 PEP-PCR 或 DOP-PCR，结合后 续的荧光 PCR 检测 DMD、SRY、Rh 等基因，结合后续的 CGH 进行 13、18、21 非整倍体 分析⑶'边。

5. 植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）

WGA 在 PGD 中的应用是最具代表性的例子。体外受精通过 PGD 进行胚胎遗传学分析，选 择正常胚胎植入，避免异常胚胎的妊娠，具有明显的遗传优生学意义。但是，PGD 所能提供的 样本量极少，仅 1〜2 个胚胎细胞，且不能反复取材。因此经过 WGA 扩增后，可获得足量 DNA 样本，进行多基因、多位点的遗传学分析. 应用于 PGD 的 WGA 方法主要为 PEP-PCR 和 DOP- PCR。PEP-PCR 与巢式或半巢式 PCR 相结合可对某些累及多个外显子或具有多种突变的单基因 进行分析，用于诊断 Duchenne 肌营养不良症、神经节昔脂 GM2 I 型、a 地中海贫血、天冬氨酰 葡糖胺尿症、婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症、家族性遗传性包涵体肌病、囊性纤维病等。 DOP-PCR 不仅可用于多基因多位点的 PCR 分析，与 CGH 相结合也可对基因组的组成、缺失或 增加进行分析。因此 DOP-PCR 的应用可望实现单次胚胎活检、单个细胞的性别、部分单基因病 和染色体病的同步诊断"I 樵

6. 比较基因组杂交（CGH）检测基因拷贝数改变

所有基因组位点都能同等程度扩增，对于检测基因拷贝数变化十分重要，特别是对于肿瘤样 本。De&n 等⑸对中期染色体进行 CGH 分析结果显示，MDA 产物和未扩增样本获得相同的结果。 此外，MDA 还可用于 DNA 探针制备，用于比较基因组、染色体组型和细针穿刺或羊水样本的 基因学芯片分析。
随着 CGH 技术的发展，出现了阵列-比较基因组杂交（array-CGH）技术，大大提高了 DNA 拷贝数异常检测的分辨率。array-CGH 的意义在于只分析数百个细胞就能检测出肿瘤甚至癌前病 变小克隆斑所不能发现的异常遗传学改变涂］。通常釆用微切割方法获取数百个细胞，因此 array- CGH 需要依赖保真性较高的 WGA 方法。MDA 可以从小量的起始细胞中获得足够 DNA 以用于 array-CGH 。

7. 用于法医工作中的检测

法医工作中经常会遇到混合样本和模板拷贝少等问题，而全基因组扩增技术能大量增加原始 模板 DNA, 因此可以单细胞中 DNA 为模板扩增，以达到检测的阈值，从而进行有效的 DNA 分 析。并且应用全基因组扩增技术可以增加实验的重复性，如法医工作中也会遇到的常规检测的 STR 位点个别缺失，或线粒体测序时出现污染等问题就可以得到有效避免，以确保案件检测的准确性。

操作方法

简并寡核苷酸引物 PCR

简介

简并寡核苷酸引物 PCR，是用一条部分随机的引物对模板基因组 DNA 进行两步 PCR 扩增。

原理

简并寡核苷酸引物 PCR 的基本原理是DOP-PCR 用一条部分随机的引物对模板基因组 DNA 进行两步 PCR 扩增。简并寡核苷酸引 物的序列为 5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3', 3'端的 ATGTGG 序列是基因组 DNA 中 分布频率极高的短序列，在第一步低温退火时起引导作用，也就是说扩增的起始位点由这 6 个 特异的碱基决定，退火有一定序列倾向性。这种在靶基因特异位点开始的扩增优于随机位点开 始的扩增，可以降低扩增结果的复杂程度。中间 6 个简并碱基可以生成 46 种不同的序列，简并碱基中 1 个或多个碱基与 3』端特异碱基一起在退火过程和模板 DNA 同时复性，加固引物与 模板 DNA 的结合作用；5'端的序列则是用于末端修饰，包括用于克隆的酶切位点。扩增反应 分两步进行：最初几个循环 (3〜5 个) 在低退火温度 (如 30°C) 下退火，使引物在模板 DNA 全长范围内随机退火并对模板 DNA 进行低严紧扩增；第二步则将退火温度升高至 62°C 特异性 退火，如同常规 PCR 进行 25〜35 个循环，对第一步低严紧扩增产物进行放大。DOP-PCR 扩增 效率高，扩增片段的长度大小在 300bp-1.7kb, 平均 500bp 左右，DOP-PCR 的扩增效率主要 依赖于引物的浓度和聚合酶的活性。在低退火温度条件下，引物能与多个基因组位点 (人类基 因组可以达到 106) 结合，扩增产物几乎覆盖全部基因组，是 WGA 中最具代表性的方法之一。

材料与仪器

器材：PCR 仪。

试剂：

①MgCl₂: 2 mmol/L；

②Tris-HCl： 10 mmol/L pH 8.4；

③KC1： 50 mmol/L；

④引物 (5‘-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG_3’)： 2 mmol/L； dNTP： 0. 2 mmol/L；

⑤Tag DNA 聚合酶： 1.25U/50μl；

⑥基因组模板 DNA 

步骤

简并寡核苷酸引物 PCR 的基本过程可分为如下几步：

(1) 反应体系 MgCl2: 2 mmol/L； Tris-HCl： 10 mmol/L pH 8.4； KC1： 50 mmol/L；引物 (5‘-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG_3’)： 2 mmol/L； dNTP： 0. 2 mmol/L； Tag DNA 聚合酶： 1.25U/50μl；基因组模板 DNA 。

(2) 扩增条件

①第一轮低严紧扩增：95°C 预变性 5 min； 94°C 变性 1 min. 30°C 复性 1. 5 min、3 min 内将温 度从 30°C 升高到 72°C、72°C 延伸 3 min, 进行 5 个循环。
第二轮特异性扩增：94°C 变性 lmin、62°C 复性 lmin、72°C 延伸 3 min (每个循环另加 Is), 进行 25〜35 个循环。

注意事项

①DOP-PCR 的扩增效率依赖于引物和聚合酶的浓度，但引物浓度太高易导致引物自连序列 和非模板相关序列的形成。

②Taq DNA 聚合酶具有较高的突变率，使 DOP-PCR 产物中有较高的变异发生。引入高保真 酶有助于提高产物的保真度。具有 3'→ 5』外切酶校正活性的 DNA 聚合酶如 Pwo(expand high fidelity fystem, roche) 和 Taq 聚合酶的混合物已用于 WGA 扩增。

③DOP-PCR 引物并非完全随机，3'端的 6 个特异性碱基使基因组扩增有一定的倾向性，这 种倾向性影响 DOP-PCR 对基因组的覆盖。但是增加 3'端特异性碱基的数目 (如增加到 8 个) 降 低 DOP-PCR 产物的复杂程度，同时使扩增产物具有一定的特异性。因此可通过增加 3'端特异性 碱基的数目来预计某些基因位点将得到扩增。

④基因组模板 DNA 量太少 (<10pg)时，DOP-PCR 扩增的均匀性下降，基因组中很大部 分将得不到扩增，出现等位基因选择性扩增或等位基因缺失、微卫星长度改变等人为假象，不能 如实反映基因组的全貌. 当样品中含有5〜10 个细胞DNA时(基因组 DNA>50pg), DOP-PCR 能为比较基因组杂交(comparative genome hybridization, CGH)提供合适的探针，但不适于染 色体作图和微卫星分析。激光显微切割可能有助于 DOP-PCR 和CGH用10〜20 个细胞对微卫星 进行分析。以诊断为目的时应该尽量增加原始模板的量，分别进行多次独立检测并使用高保真的 DNA 聚合酶。

⑤DOP-PCR扩增片段的长度大小在300bp〜l.7kb, 平均500bp左右。通过使用具有3'→5' 外切酶校正活性的 DNA 聚合酶Pwo和延长复性、延伸时间可以获得10kb的长片段产物，为后 续的PCR提供可信度更高的模板，使后续PCR可以获得大于 1kb的特异基因产物。

⑥苏木素-伊红(haematoxylinYosin, HE)染色标本不适于 DOP-PCR, 高浓度的苏木素降 低DOP-PCR产物的质量，因此进行DOP-PCR扩增的微切割组织应避免用HE染色。

对于浸润型肿瘤如少胶质细胞瘤组织常与正常组织交织混杂，组织微切割有助于获得相 对一致的肿瘤细胞，DOP-PCR与CGH对微切割组织的分析有助于揭示肿瘤细胞的真正细胞遗 传学特征。

引物延伸预扩增PCR

简介

引物延伸预扩增PCR，是随机扩增整个基因组 DNA 的方法。

原理

引物延伸预扩增PCR的基本原理是PEP-PCR以随机组成的15个碱基寡核昔酸为引物，这种引物在理论上有415种排列顺序， 在低温(37°C)下随机与基因组 DNA 的大量位点退火，55°C延伸，并且每个循环的退火温度都 是由37°C连续升温至55°C，确保不同组成的引物与尽可能多的基因组序列退火，随机扩增整个 基因组 DNA。PEP-PCR可以使基因组 DNA放大几十倍。扩增产物经过特异基因位点的巢式或 半巢式PCR鉴定扩增效率和保真度。PEP-PCR的扩增效率低于DOP-PCR, 无法用常规的方法 检测产物的片段大小，但它的覆盖率却高于DOP-PCR。因而DOP-PCR用于CGH可以获得满意 的结果，而PEP-PCR的CGH信号非常微弱；但是，改良的PEP-PCR可用单个肿瘤细胞进行微 卫星的分析。

材料与仪器

器材：PCR 仪。

试剂：

①DNA模板 10μl；

②随机引物 5μl(400 Mmol/L)；

 ③PCR 缓冲液 6μl(MgCl2 25 mmol/L, 明胶 lmg/mL , Tris-HCl 100 mmol/L, pH8. 3 ) ；

 ④2 mmol/L dNTP 3μl；

⑤Taq DNA 聚合酶 5U；

⑥补充水至 60μl。

步骤

引物延伸预扩增PCR的基本过程可分为如下几步：

DNA模板 10μl；随机引物 5μl(400 Mmol/L)； PCR 缓冲液 6μl(MgCl2 25 mmol/L, 明胶 lmg/ml , Tris-HCl 100 mmol/L, pH8. 3 ) ； 2 mmol/L dNTP 3μl；Taq DNA 聚合酶 5U；补充水至 60μl

94°C lmin^37°C 2 min—55°C 4 min (以 l°C/10s 从 37°C升高到 55°C)共 50 个循环。

注意事项

①外源DNA和其它细胞DNA的污染是单细胞PCR的一大难题，因此需严格按操作规程操 作，避免人为污染。为减少污染风险，应建立污染评估指标，如检测多个具有高度多态性和可遗 传性的短串联重复序列(short tanderm repeat, STR)。

②PEP-PCR的重复性和扩增产物的准确性依赖于原始模板的数量和质量。由于原始模板量 少，PEP-PCR产物中每一特定DNA 序列的拷贝数也是有限的，因此在进行后续的巢式或半巢式 PCR时应考虑加入PEP-PCR产物的量。原始模板的量和 PEP-PCR产物的量决定后续PCR的质 量及结果分析。

③由于在低拷贝条件扩增容易发生错配，单细胞全基因组扩增用于植入前遗传学诊断时要 考虑到PCR 反应引入错误而导致误诊的风险，因此扩增过程中釆用高保真DNA 聚合酶是必 要的。

④对于浸润型肿瘤，肿瘤细胞常与正常细胞交织混杂，用激光显微切割有助于获得纯化的 肿瘤细胞，从而避免正常细胞的污染。

⑤PEP-PCR扩增的效率因细胞处理的条件不同而有较大的差异，福尔马林固定的石蜡切片 组织细胞的扩增效率明显低于新鲜细胞。但福尔马林固定的石蜡切片是获得纯肿瘤细胞的常用方法，因而，为获得准确的结果应尽量取更多的细胞。

⑥显微组织切割过程中容易造成染色体和DNA丢失，引起人为的等位基因丢失。而且对冰 冻或新鲜组织的处理过程要迅速，避免基因组 DNA的降解。

连接物 PCR

简介

连接物PCR，是用特定的 DNA序列连接DNA片段，从而达到扩增整个基因组的目的的方法。

原理

连接物PCR的基本原理是由于适于PCR扩增和CGH分析的DNA片段最适长度为0. 2~2.0kb, 因此将基因组DNA 用识别四位点的限制性内切酶(如MseI , 识别TTAA)酶切，产生100〜1500bp的DNA片段， 并在片段的两端连接特定性的DNA序列(adaptor), 并以与该序列互补的DNA序列作为引物扩 增修饰的DNA片段，从而达到扩增整个基因组的目的。

材料与仪器

器材：PCR仪。

试剂：

①A45B/B3单克隆抗体(Micromet, Martinsried, Germany)

②荧光标记的羊抗鼠多抗(The Jackson Laboratory)

③Pick 缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl pH8. 3, 75 mmol/L KC1, 3 mmol/ L MgCl2, 137 mmol/L NaCl)

④蛋白酶 K 消化缓冲液(10 mmol/L Tris-acet&te pH7.5, l0 mmol/L MgAc2, 50 mmol/L KAc 

⑤0.67% 吐温-20, 0. 67%Igepal, 0. 67 mg/ml 蛋白酶 K)

⑥One-Phor-All- Buffer-Plus 缓冲液(Pharmacia)

⑦限制性内切酶 Mse I (New England Biolabs)

⑧T4 DNA 连接酶 (Boehringer Mannhein)

⑨10 X PCR 缓冲液(Boehringer Mannhein, Expand Long Template, 缓冲液1)

⑩Taq及Pwo DNA聚合酶。

步骤

连接物PCR的基本过程可分为如下几步：

(1) 基因组DNA的制备及酶切： 从骨髓抽吸细胞分离单个核细胞，经0.05% 的多聚甲醛固 定后用A45B/B3单克隆抗体和荧光标记的羊抗鼠多抗对肿瘤细胞进行标记，经显微操作分离荧 光细胞，置于含1μl Pick缓冲液的PCR管，加入2μl的蛋白酶K消化缓冲液，42C 孵育 10 h, 80°C处理 lOmin 使蛋白酶 K 灭活，然后加入 0. 2μl One-Phor-All-Buffer-Plus 缓冲液，0. 5 U Mse I 和 1.3μl H₂O₂, 37°C 消化 3 h。

(2)引物和 adaptor： MseLig21 引物(5『-AGTGGGATTCCGCATGCTAGT-3『)，MseLigl2 引物(5』-TAACTAGCATGC-3』), 分别溶于引物稀释液(Metabion Martinsried, Germany)使终 浓度为l00μmol/L, 两种引物一起退火可作为adaptor, MseLig21引物可作为PCR引物。

(3)DNA片段与adaptor连接： 在上述制备的基因组DNA中加入MseLig21和MseLigl2引 物溶液各0.5μl，再加入1.5μl去离子水、0. 5ptl One-Phor-All-缓冲液，从65°C孵育10 min (引物 变性，同时灭活内切酶)后逐渐降温至15°C复性 (降温速度1°C/1 min)。然后加入ATP (10 mmol/L)1μl, T4 DNA 连接酶 1μl (5U), 16°C过夜连接。

(4)LA-PCR扩增： 在上述反应体系中，加10XPCR缓冲液3μl、10 mmol/L dNTPs 2μl、去 离子水35μl。68C变性4 min, 去除MseLigl2引物，接着加入 1μl Taq和 Pwo 聚合酶混合物 (3.5U), 孵育 3 min后进行如下循环：94°C 40s -> 57°C 30s -> 68°C (lmin 15s), 14 个循环；94°C 40s -> 57°C 30s -> 68°C (lmin 45s), 34 个循环；94°C 40s->57°C 30s->68°C5 min, 反应结束。

注意事项

LA-PCR扩增的效率较高，不受产物长短的影响，而且扩增产物的序列选择性偏移较少，但 是扩增前的操作繁琐，在单细胞操作时可能丢失部分基因组DNA。