简介

在常规的蛋白质斑点印迹试验中，印迹膜封闭 1 小时后，与一抗反应 1 小时，再与二抗反应 1 小时。在允许灵敏度较低的情况下，封闭、一抗、二抗等几步可结合进行, 这样可加快速度，花不到 15 分钟即可。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。

操作方法

快速蛋白质斑点印迹试验

材料与仪器

Tris缓冲盐溶液(TBS) TBS+1%牛血清白蛋白 TBS+0.1%Tween-20(TBST) 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸 氮蓝四唑(BCIP NBT)显色试剂 鼠抗σ32单克隆抗体3RH2(MAb 3RH2) 兔抗鼠免疫球蛋白G(IgG)~碱性磷酸酶缀合物
硝酸纤维素膜

步骤

材料与设备

硝酸纤维素膜（Schleicher&Schuell,Inc.)

鼠抗σ³²单克隆抗体3RH2(MAb 3RH2)

兔抗鼠免疫球蛋白G(IgG)~碱性磷酸酶缀合物

试剂

Tris缓冲盐溶液(TBS)

TBS+1%牛血清白蛋白

TBS+0.1%Tween-20(TBST)

5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)显色试剂

(配方，见“试剂的配制”,pp.184~189)

操作程序

1)取一小块方形的硝酸纤维素膜打上格子，并编号。再将其置于一片纸巾上，用TBS润湿硝酸纤维素膜和纸巾。

2)用刮勺或吸头使硝酸纤维素膜对纸巾貼平，在硝酸纤维素膜上按格所示的位置处点1-ul样品。

3)点样后静置2min,让样品藉毛细作用透过硝酸纤维素膜，然后将膜置于抗体/BSA溶液（鼠抗σ32MAb 3RH2和兔抗鼠IgG-碱性磷酸酶缀合物，各按1/1000稀释于TBS+1%BSA液)中。

注：我们发现，当样品含过量聚乙稀亚胺（PEI)时（如在PEI浓度很高情况下由FEI沉淀得到的样品)，可引起假阳性反应，且多半是与MAb结合的。印迹在与混合杭体孵育前，于TBS+1%BSA中封闭2min,可减少这种假阳性。

4)在缓缓摇动下，与抗体结合至少6min,然后吸出上清（留样供进一步作印迹分析用)，用TBST快速洗涤硝酸纤维素膜二次。

5)再用TBST洗硝酸纤维膜3次，每次至少1min,然后迅速用水冲洗，再加入BCIP/NBT显色剂。

6)斑点显色5~20mm,然后用水冲洗硝酯纤维膜，轻轻拍干，并在收入实验记录前使其完全干燥。