简介

本实验介绍肝素-Sepharose CL-2B 的制备过程。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。

操作方法

肝素-Sepharose CL-2B 的制备实验

材料与仪器

SepharoseCL-2B 乙腈 溴化氰 甘氨酸 NaOH 肝素 Na2CO3 NaHCO3 盐酸乙醇胺 NaAc NaCl 尿素 NaCl3 Tris-HCl EDTA 叠氮钠

步骤

材料

SepharoseCL-2B(PharmaciaBiotech,Inc.)

乙腈

溴化氰（CNBr)(AldrichChemicalCo.C9149-2)

甘氨酸

NaOH

肝素（钠盐；USP 级；制自猪肠粘液，140U/mg)[LifeTechnologies,Inc.(GIBCO/BRL)15077-027〕（每次制备需要 500000U)

试剂

Na₂CO₃(2mol/L)

NaHCO₃(0.1 ml/L;PH9.5)

NaHCO₃(0.2mol/L；pH8.5)

盐酸乙醇胺 (1mol/L;pH8.0)

NaAc(0.1mol/L;pH4.0)/NaCl 0.5mol/L)

尿素 (2mol/L)/NaCl(0.5mol/L)

NaHCO₃(0.lmol/L；pH10.0)/NaCl₃(0.5 ml/L)

Tris-HCl(100mmol/L;pH7.9)/EDTA(2 mmol/L)/叠氮钠 (0,04%,w/v)

(配方，见”试剂的配制“,pp.131~138)

操作程序

本方案是根据 March 等（1974) 方法改进而成。

1) 用至少 1000 ml 重蒸水洗涤 250 mlSepharoseCL-2B(以床体积计)

注：操作 SepharoseCL-2B 要轻缓，以免损伤琼脂糖凝胶颗粒。

2) 于 2000-ml 塑料烧杯中，将 250 ml 洗过的 SepharoseCL-2B 和 750 ml 2mol/LNa₂CO₃ 混合，用磁力搅拌器搅拌。

3) 在通风橱中，将 12.5 ml 乙腈加入 25 g 溴化氰中，用玻璃榉搅拌溶解。

4) 室温下，用巴氏吸管将溴化镢溶液转移至搅拌着的 SepharoseCL-2B 中。

5) 室温下，混合物搅拌 2 min。

6) 将混合物转移至 600-ml 粗烧结玻板漏斗，快速、温和地用 1000ml 0.1mol/LNaHCO₃(pH9.5)、1000 ml 重蒸水和 1000 ml 0.2mol/LNaHC3(pH8.5) 洗涤混合物。

注：不要让溴化氰活化好的胶干成饼状！

滤液中加入 20 g 甘油和 20 g NaOH, 于通风橱中放置过夜后弃去。

7) 于 500-ml 塑料瓶中，将 3 g 肝素（500000U) 溶于 250 ml 0.2mol/LNaHCO₃(PH8.5) 中。

注：从不同厂商买来的肝素制品用于肝素-琼脂糖层析时，其性质有很大不同。事实上，有些肝素制品用于肝素-琼脂糖层析时是完全无效的，当然，我们也不是非用"材料"一节所列的特定来源 GIBCO/BRL) 的肝素制品不可。

8) 将经溴化氰活化的胶转移至含肝素溶液的 500-ml 塑料瓶中（所有溶液均应置室温下)。

9)4°C 下混合 20 h。

10）通过烧结玻板漏斗过滤收集肝素-Sepharose 胶。用 400 ml1moI/L 盐酸乙醇胺 (pH8.0) 悬浮，室温下至少混合 4 h。

11) 分别用 2000 ml0.lmol/LNaOAc(pH4.0)/0.5mol/LNaCl、2000 ml2mol/L 尿素/0.5mol/LNaCl、2000 ml 0.1mol/LNaHCO₃(pH10.0)/0.5mol/LNaCl 和 2000 ml 重蒸水洗胶。

12) 将制备好的胶悬浮于 250 ml100 mmol/LTris-HCl(pH7.9)/2 mmol/LEDTA/0.04% 叠氮钠中。