简介

鉴定蛋白质中磷酸化的氨基酸残基是很有意义的。磷酸化作用发生在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酩氨酸时，通过部分的HCl水解及接着进行双向薄层电泳，可以便利地鉴定 标记的磷酸氨基酸。

操作方法

免疫印迹分析

材料与仪器

蛋白质样品
钒酸钠 封阻液 TN TNA Tris·Cl 叠氮钠 印度墨汁染色液 TBS
吸水纸 水浴锅

步骤

1.  用等体积的2×SDS上样缓冲液溶解培养细胞，组织或裂解物，煮沸5 min。

2.  在SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳样品，用含100 μmol/l 钒酸钠的转移缓冲液将蛋白质转移至适用于免疫印迹分析的膜上。

3.  膜在室温下用30~50 ml 封阻液封闭30 min 以上。

4.  在带盖的塑料容器内，膜与30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗体溶液室温温育60~120 min，间或摇动。

5.  取出膜，用吸水纸吸干多余液体，在一个新的塑料容器内，用TBSA溶液洗膜 2次，每次10 min；50 ml NP-40洗膜液洗膜2次，每次10 min；再用50 ml TBSA洗膜2次，每次5 min，弃洗液。

6.  用30~50 ml 含0.5 μCi/ml ¹²⁵I 标记蛋白A与膜在室温下温育60 min，间或摇动。

7.  移出膜，用吸水纸吸干多余液体，同步骤5洗膜。 

8.  如果需要，用30~50 ml 墨汁染色液染膜5~10 min，直到有可见蛋白带，充分洗膜除掉多余的墨计。

9.  用吸水纸吸干多余液体，用塑料包装膜包好，加上放射性或荧光的位置标记后，用经预闪光致敏的X光片和增感屏，自显影18 h至10天。

化学发光法（非标记蛋白质的磷酸化作用分析实验）

材料与仪器

蛋白质样品
钒酸钠 封阻液 TN TNA Tris·Cl 叠氮钠 印度墨汁染色液 TBS
吸水纸 水浴锅

步骤

1.  如基本方案步骤1所述，用SDS-聚丙烯醜胺凝胶电泳分离样品，使用含100 μmol/l 钒酸钠的转移液将蛋白质转印至硝酸纤维素滤膜上。 

2.  在塑料容器内，膜与不含叠氮钠的封阻液在室温温育至少30 min。

3.  室温下膜与30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗体温育60~120 min，间或摇动。 

4.  在一干净的塑料容器内，用TN缓冲液冼膜2次，每次10 min；用含0.05%NP-40的TN缓冲液洗膜2次；毎次10 min 再用TN缓冲液洗膜2次，毎次5 min 弃冼液。 

5.  加入30~50 ml 针对第一抗体的过氧化物酶偶联的第二抗体，室温温育60 min，间或摇动。 

6.  如步骤4所述洗膜。
 
7.  在比膜稍大的塑料容器内，等体积混合用于ECL检测的鲁米诺试剂和氧化剂。 

8.  将膜（含蛋白质样品的一面朝上）浸入混合试剂，轻摇60 s。

9.  取出膜，沥干多余液体，置于塑料保护膜内，蛋白质朝上。 

10.  在暗室内对X光片曝光15 s~30 min。