简介

使用基因融合表达系统在大肠杆菌中表达外源基因已越来越受欢迎，这在很大程度上归因于融合条统能够产生大量的可溶性的融合蛋白。

操作方法

融合蛋白的酶解实验

材料与仪器

融合蛋白
SDS
水浴锅 培养箱 离心机

步骤

1.  准备两个小量预试验反应以确定最佳温育时间：
 
（1）反应1：20 μl 含有1 μl 200 μg/ml Xa因子的1 mg/ml 融合蛋白，室温下反应

（2）反应2：5 μl 不含因子Xa的1 mg/ml 融合蛋白（模拟消化），室温下反应。
 
2.  分别在2、4、8和24 h取出5 μl 反应液，加2×SDS样品缓冲液5 μl，-20℃下冻存。

3.  在24 h 时，将5 μl 反应2（模拟消化）液与5 μl 2×SDS样品缓冲液混合。

4.  将5 μl 原始融合蛋白溶液与5 μl 2×SDS样品缓冲液混合。
 
5.  将所有样品于沸水浴中加热10 min，加样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，根据裂解程度确定适当的温育时间。
 
6.  确定了适当的裂解条件后，将余下的融合蛋白样本按比例扩大反应，仅留小量的未裂解融合蛋白作对照用。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳监测裂解程度。

（融合蛋白的酶解实验）备选方案

材料与仪器

融合蛋白
SDS 钠盐 凝血酶裂解液 凝血酶
水浴锅 培养箱 离心机

步骤

1.  准备两个小量预试验以确定最佳裂解反应条件：
 
（1）反应1：20 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液（在合适的缓冲液中）及0.2 μg 凝血酶。

（2）反应2：5 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液（模拟消化），25℃下温育反应。
 
2.  在30 min、1 h、2 h 和4 h 等时刻从反应1中分别取出5 μl 反应液与5 μl 2×SDS样品缓冲液混匀，-20℃冷冻。

3.  在4 h，往反应2（摸拟消化）中加入5 μl 2×SDS样品缓冲液。
 
4.  将5 μl 原始的融合蛋白溶液与5 μl 2×SDS样品缓冲液混匀。

5.  将所有样品煮沸10 min，加样于SDS-聚丙烯酰氨凝胶上分析样品的稳定性以及裂解的效率。
 
6.  采用试验所得的最佳融合蛋白裂解条件，按比例任意扩大蛋白裂解反应。

辅助方案

材料与仪器

融合蛋白
SDS 盐酸胍 CaCl2
水浴锅 培养箱 离心机

步骤

1.  将融合蛋白在≥10倍体积的20 mmol/l Tris·Cl（pH7.4）/6 mol/l 盐酸胍中透析4 h，或将盐酸胍加入融合蛋白中至终浓度为6 mol/l。

2.  将样品在100倍体积的20 mmol/l Tris·Cl（pH8.0）/1 mmol/l CaCl₂透析4 h。

3.  更换100倍体积的新鲜缓冲液重复步骤2，继续透折4 h。

4.  按“基本方案”步骤1进行Xa因子的裂解。