简介

当前，所谓蛋白质测序，主要指的是蛋白质的一级结构的测定。蛋白质的一级结构（Primary structure）包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。

操作方法

蛋白质的微量测序分析实验

材料与仪器

蛋白质
凝胶缓冲液 谷胱甘肽 疏基乙酸 考马斯亮蓝
电泳仪 微量注射器

步骤

1.  制备分离胶和积层胶溶液灌制变性微型凝胶。
 
2.  组装垂直凝胶电泳装置。
 
3.  将80 ml 4×凝胶缓冲液稀释至320 ml。将200 ml 1×凝胶缓冲 液倒入下层缓冲液槽。

4.  剩余的1×凝胶缓冲液加入还原型谷胱甘肽（干粉）至终浓度1 mmol/l，将它们倒入上层缓冲液贮槽。将凝胶连接于恒压/恒流电源。

5.  10 mA 下预电泳45 min。

6.  关闭电源，将凝胶放置过夜。

7.  倾出凝胶缓冲液，用纸巾或滤纸吸干加样孔。
 
8.  将10×上槽和下槽缓冲液稀释至1×往下槽倒入200 ml 下槽缓冲液，150 ml上槽缓冲液加入0.1 g 巯基乙酸（钠盐）后，倒入上槽。

9.  用微量注射器或凝胶加样吸头将溶于凝胶缓冲液的蛋白质样品加入凝胶的加样孔。
 
10.  在10 mA 下电泳至粉红色的示踪染料达到凝胶的底部，关闭电源。
 
11.  用甲醇润湿2张PVDF膜，然后浸没在转移缓冲液中。

12.  拆卸凝胶夹层，轻轻将玻璃板分开。
 
13.  按下面的次序在小型转移装置中组装转印夹层：塑料框、海绵、滤纸、凝胶、2张PVDF膜、滤纸、海绵、塑料框。

14.  将转印夹层插入转移装置，最靠近阳极（红色或正极）的是膜。用转移缓冲液充满装置。
 
15.  在转移装置电极间的电压降为6 V/cm 的条件下，转移时间因目标蛋白和凝胶的浓度而异。
 
16.  拆卸转印装置，取出PVDF膜，将它浸没于含0.1%考马斯亮蓝的50%甲醇中，摇动 5 min。
 
17.  用含10%乙酸的50%甲醇脱色，摇动至条带变得清晰可见。

18.  转印膜移入水中，拍照。
 
19.  用刀片将目标蛋內的条带切下（每条带均用新的刀片），将每一条带放入微量离心管中，室温风干（不要加热），切下的条带贮存于- 20℃

20.  将切下的条带放入测序仪的反应室，蛋白面朝向溶剂液流。

21.  在自动化测序仪中测序。

测定N-末端封闭蛋白质的内部序列

材料与仪器

蛋白质
乙酸 NaOH 丽春红染料 三氟乙酸
纤维素膜 离心管 滤膜

步骤

1.  电泳分离目标蛋白并转移到硝酸纤维素膜。

2.  将硝酸纤维素膜放入盛有50 ml 含0.1%丽春红S料的1%乙酸水溶液的经酸洗的petri 玻璃培养皿。轻轻摇动1 min。

3.  将膜移入1%乙酸1 min，如有需要，换液至条带显迹清晰。

4.  穿带无粉尘手套用刀片将目标蛋白条带切下，小心切去多余的硝酸纤维素膜后，放入微量离心管中，取一片空白膜作对照。

5.  将膜放入1 ml 0.2 mmol/l NaOH中，振荡1 min 脱色，吸去NaOH。

6.  立即加入1 ml 含0.5%PVP-40的0.1 mol/l 乙酸中，室温下轻轻摇动管子30 min。

7.  吸去PVP-40，用1 ml 水洗膜5次。小心除去留于管帽下的任何液滴。

8.  用清洁的细头镊子将膜片转移到干净的玻璃表面（如经酸洗的玻璃平板或petri培养皿），切成1~2 mm 的小片，用镊子收集膜片，挤去过量的液体。

9.  立即将膜的碎片移入盛有25 μl 消化缓冲液的0.5 ml 微量离心管中，加入1 μl 1 mg/ml 的胰蛋白酶，混匀使膜均匀地泡于溶液中，室温放置过夜。

10.  室温高速微量离心1 s，回收粘在管壁和盖子上的液滴。

11.  室温超声处理样品5 min。

12.  室温用最大速度微量离心1 min 将上清移入离心过滤装置，用100 μl 消化缓冲液洗膜碎片，合并于上清，在最大速度微量离心样品20~30 s。

13.  用95%层析A液 / 5%B液，以0.15 ml/min 的流速平衡2.1 mm×250 mm 的反相HPLC柱，有层析炉可用吋，在60℃进行以优化分辨效果。

14.  注射样品，用95%层析A液 / 5%B液洗柱子10~15 min。

15.  用如下的梯度洗脱多肽：5%~40%B液1 h 以上，40%~75%B液30 min 以上，75% ~100%B液15 min 以上，在215 nm 监测多肽的洗脱。

16.  用图形记录仪根据全量程的波型调整至0.05~0.1 AUFS监测多肽洗脱峰的出现。

17.  当图型记录仪开始摆动说明有洗脱峰出现时，对准一干净的表面擦毛细管的尖，用微量离心管收集分部组分。

18.  立即盖好盖子，置于干冰或于-70℃贮存。

19.  加样于按Applied Biosystems所述方法经Polybrene预处理的玻璃纤维滤膜支持体中，进行测序。