简介

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

操作方法

离子交换层析介质和层析柱的选择

材料与仪器

步骤

1.  离子交换凝胶的选择依据：
（1）根据蛋白质的pH只稳定范围。蛋白质在等电点pI以上pH稳定时选择阴离子交换凝胶介质，在pI以下pH的稳定时，则选用阳离子交换凝胶介质。

（2）根据特分离蛋白质的分子大小。分子量在10 000~100 000 0 Da 的蛋白，选用如DEAE-Sephacel和DEAE-Sepharose样凝胶；更大的分子，用Sephadex A-25或C-25。
2.  柱子大小取决于听用凝胶的结合容量，使用最频繁的是1 cm、2 cm、2.5 cm 直径，柱长通常少于之20 cm 对成分复杂的样品，用更大的柱子，

3.  有商品供应的预装的FPLC离子交换柱可用。它们是Pharmacia的mono-Q（阴离子）和Mono-Q（阳离子）柱，有三种大小尺寸：0.5 mmx5 cm（25 m样品）、1 cmx10 cm（200 mg 样品）和 1.6 cmx10 cm（500 mg 样品）。

🔥 离子交换层析实验（IEC）

合作专家 | 周康硕士

分子生物学 安徽农业大学

原理

离子交换层析用于蛋白质分离的原理的最简单解释是，基于带相反电荷分子间的相互吸引力。蛋白质表面所带的电荷取决于其 pI 和环境 pH。构成离子交换剂的基础介质通常为多孔珠形式,可以为蛋白质的吸附提供足够大的表面积。固定于基础介质上的带电配基可以带正电荷也可以带负电荷。

为提高介质的结合容量，可将带电荷的多聚体取代小分子配基植于介质上。无论电荷配基的分子大小，我们可以将其分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂带负电荷，而阴离子交换剂带正电荷。大于 pI 时，蛋白质带负电荷,可与阴离子交换剂结合;小于 pI 时，蛋白质带正电荷，可与阳离子交换剂结合。

前面我们已经讨论了这种简单规则的局限性。离子交换剂本身就相当于酸或碱，而电荷的歧化反应取决于其 pH。强的离子交换剂，本身相当于一种强酸或强碱，在较宽的 pH 范围内，所带的电荷不会发生改变;但是，弱离子交换剂却会发生改变。可根据此特性开发离子交换剂的选择性或采用 pH 梯度洗脱。带电样品与离子交换剂的结合可以通过Boardman和Partridge(1955)提出的质量作用定律进行描述。

Fred Regnier 和其研究组扩展了此定律(Kopaciewiczetal，1983)。蛋白质的保留时间和盐浓度决定了其与基质表面相互作用的结合位点数量。一般在低盐浓度时使蛋白质结合，而在高盐浓度时洗脱蛋白质。等度洗脱的洗脱窗口很低，因此通常以线性盐浓度梯度洗脱蛋白质。

用途

根据蛋白质质表面电荷的不同，分离纯化目的蛋白。

材料与仪器

试剂：氯化钠溶液、平衡缓冲液为 20mMTris（pH8.0）洗脱缓冲液：20mMTris 1MNaCL（pH8.0）SDS-PAGE

材料：层析柱、色谱填料

仪器：pH 计、匀质机、离心机、蛋白纯化仪

步骤

IEX 分离中的步骤：IEX 介质包含被带负电荷或正电荷的离子基团取代的球形颗粒基质。基质通常是多孔的以提供高内表面积。将介质填充到柱中以形成填充床，然后用填充基质孔隙和颗粒之间空间的缓冲液平衡床。

 

一、平衡

第一步是将固定相平衡到所需的起始条件。当达到平衡时，所有固定相带电基团都与可交换的反离子（例如氯离子或钠离子）结合。选择起始缓冲液的 pH 值和离子强度，以确保在上样时，感兴趣的蛋白质与介质结合，并且尽可能多的杂质不结合。

 

二、上样和清洗

此步骤的目标是结合目标分子并洗掉所有未结合的材料。样品缓冲液应具有与起始缓冲液相同的 pH 值和离子强度，以结合所有带电靶蛋白。带相反电荷的蛋白质与 IEX 介质的离子基团结合，集中在色谱柱上。不带电荷的蛋白质或与离子基团具有相同电荷的蛋白质以与缓冲液流速相同的速度通过色谱柱，在上样期间或之后洗脱，具体取决于上样的总体积。

 

三、洗脱

当所有样品都已上样并用起始缓冲液清洗柱子以使所有未结合的蛋白质都通过柱子时，改变条件以洗脱结合的蛋白质。最常见的是，通过增加缓冲液的离子强度（盐浓度）或偶尔通过改变 pH 值来洗脱蛋白质。

随着离子强度的增加，盐离子（通常是 Na+ 或 Cl-）与结合的组分竞争介质表面的电荷，一种或多种结合的物质开始洗脱并沿色谱柱向下移动。随着离子强度的增加，在选定的 pH 值下具有最低净电荷的蛋白质将是最先从色谱柱中洗脱下来的蛋白质。

类似地，在某个 pH 值下具有最高电荷的蛋白质将被最强地保留并最后被洗脱。蛋白质的净电荷越高，洗脱所需的离子强度就越高。通过使用不同形式的梯度控制离子强度的变化，蛋白质以不同的方式以纯化的浓缩形式洗脱。

注意事项

蛋白质在低盐浓度下可能发生沉淀，所以，在选择盐溶液之前，应先评估蛋白质复合物在给定盐溶液中的溶解性。

1.离子交换剂的选择

应用子剂提高得率和分辨率的我要环节。任何一种离子交换剂都不可能适用于所有的样品物质的分离，因此必须根据各类离子交换剂的性质以及待分离物质的理化性质，选择一种最理想的离子交换剂进行层析分离。选择离子交换剂的一般原则如下:

①选择阴离子或阳离子交换剂，决定于被分离物质所带的电荷性质。如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂;如带负电荷，应选择阴离子交换剂;如被分离物为两性离子，则一般应根据其在稳定性质来选择交换剂的种类。

蛋白质属于两性电解质，所带电荷取决于所处缓冲液的 pH 大小。当蛋白质等电点大于其所在缓冲液 pH 时，蛋白质带正电荷，应选用阳离子交换剂;当蛋白质等电点小于其所在缓冲液，蛋质负，应选用阴离子交换剂。

② 强型离子交换剂适用的 pH 范围很广，所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端 pH 溶液中解离且较稳定的物质。弱型离子交换剂适用的 pH 范围狭窄，在 pH 为中性的溶液中交换容量高，用它分离生命大分子物质时，其活性不易丧失。

强酸性阳离子交换树脂虽然可与很多阳离子交换，但对正电荷的胶体和高分子阳离子都不易吸附或吸附很少，所以一般用弱酸性树脂分离碱性蛋白质。强、弱型离子交换剂的交换容量与适用 pH 范围的比较。

③ 离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择 H 型和 OH 型:弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择 Na 型和 Cl 型。

交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质有不同的作用性质。(如吸附、分子筛、离子或非离子的作用力等)，因此对被分离物质的稳定性。

常见问题

1、蛋白质在低盐浓度下可能发生沉淀，所以，在选择盐溶液之前，应先评估蛋白质复合物在给定盐溶液中的溶解性。

2、缓冲液的 pH 对于蛋白质结合于 IEX 吸附剂的影响并呈一般性的趋势，可以影响相互作用的强度。选择缓冲液的 pH，应该确保蛋白质和吸附剂在该环境下能够稳定(如避免使用极端 pH 溶液)。

3、可加少量还原剂或者去污剂防止蛋白聚集。

4、蛋白高盐洗脱后尽快换至稳定缓冲液中。