简介

蛋白质染色可用于（1）蛋白质的观测（2）蛋白质含量的测定。

操作方法

考马斯亮蓝染色（蛋白质染色实验）

原理

1. 凝胶中蛋白质的定位可用考马斯亮蓝染料染色或银染色。前者简便且快捷，而银染法具有相当高的灵敏度，能用于检出更少量的蛋白质。

2. 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。

3. 考马斯亮蓝在酸性条件下为棕红色，其所含的疏水基团在酸性条件下雨蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在595nm处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料复合物在595nm下的吸光度与蛋白质量成正比。

材料与仪器

蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶 固定液 染色液 脱色液
滤纸 培养箱

步骤

1.  将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器并以3~5倍体积的固定液覆盖，在旋转摇床中缓慢揺动2 h。
 
2.  倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液覆盖凝胶，并缓慢摇动4 h。

3.  倾去染色液，用约50 ml 固定液冲洗凝胶。
 
4.  倾去固定液，以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动2 h，倾去脱色液，再加入新脱色液同时至获得蓝色条带及干净的背景。凝胶可放置在乙酸或水中保存。

5.  需要时，给凝胶拍照。
 
6.  另外，也可将凝胶放在两张Whatman 3MM 滤纸上，顶上盖上塑料保鲜膜。在常规的凝胶干燥机中于80℃干燥1~2 h。

注意事项

1.  带手套并仅在通风橱中进行。

2.  由于氨银溶液干燥后会发生爆炸，应马上用大量水冲去。

3. 不可使用石英比色皿（染色不易洗掉） ，可用塑料或者玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。

银染法

材料与仪器

蛋白质
脱色液 戊二醛 硝酸银 洗印显影液
培养箱 摇床

步骤

1.  将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器并以5倍体积的固定液覆盖，在旋转摇床中缓慢摇动30 min 以上。

2.  倾去固定液，加5倍凝胶体积的脱色液，缓慢摇动60 min 以上。

3.  倾去脱色液，加5倍凝胶体积的10%戊二醛，在通风橱中缓慢摇动30 min。

4.  倾去戊二醛溶液，用水洗凝胶4次以上，每次30 min 以上，最后一次洗涤以过夜为佳。缓慢摇动。

5.  倾去水，将凝胶置于约5倍凝胶体积的硝酸银溶液中平衡（完全盖没凝胶），剧烈振荡 15 min。

6.  将凝胶移至另一塑料盒，用去离子水洗5次，每次精确5 min，缓慢摇动。

7.  用500 ml 水稀释25 ml 显影液，将凝胶移至另一塑料盒，加入足够的稀释显影液盖没凝胶，并剧烈摇动至条带达到需要的强度。如果显影液变成棕色，须换新鲜的显影液。

8.  换快速定影液，定影5 min，必要时，用湿润了的棉花擦去凝胶表面沉积的残余银沉积物。顿去定影液，用水彻底冲洗凝胶。

9.  凝胶拍照，干胶或在可密封的塑料袋中保存。

注意事项

1.  带手套并仅在通风橱中进行。

2.  由于氨银溶液干燥后会发生爆炸，应马上用大量水冲去。

非氨盐银染法

材料与仪器

蛋白质
DTT 硝酸银 碳酸盐显影液 柠檬酸
摇床

步骤

1.  将凝胶置于玻璃或聚乙烯容器中，加入100 ml 固定液，在旋转摇床中缓慢摇动30 min。
 
2.  倾去固定液，将凝胶浸没在脱色液中，缓慢摇动30 min。
 
3.  倾去脱色液，加50 ml 10%戊二醛，在通风橱中缓慢摇动10 min。
 
4.  倾去戊二醛，用水彻底洗凝胶2 h，期间换水几次以保证获得低本底水平。

5.  倾去水，以100 ml ug/ml 的DTT浸泡凝胶30 min。
 
6.  倾去DTT溶液，不用冲洗，直接加入100 ml 0.1%硝酸银溶液，缓慢摇动30 min。

7.  倾去硝酸银溶液，用小量水快速冼凝胶1次，然后用小量碳酸盐显影液快速洗2次。

8.  将凝胶浸泡在100 ml 碳酸盐显影液中缓慢摇动，直至获得所需的显色水平。

9.  每100 ml 碳酸盐显影液中加入2 ml 2.3mol/l 柠檬酸，并缓慢摇动10 min 以终止染色。
 
10.  倾去液体，用水冼几次，缓慢摇动30 min。
 
11.  凝胶拍照，凝胶在0.03%碳酸钠中浸泡10 min，用塑料保鲜膜包裹或密封于可热密封的袋子中保存。