简介

特殊蛋白质的分离纯化是在要弃除非蛋白质物质成分后，利用不同蛋白质之间的差异性将目的蛋白提纯出来。充分了解目的蛋白的来源、理化特性以及纯化目的，有助于选择合理的分离纯化方法，达到事半功倍的效果。

原理

特殊蛋白质的分离纯化的基本原理是在要弃除非蛋白质物质成分后，利用不同蛋白质之间的差异性将目的蛋白提纯出来。需要充分了解目的蛋白的来源、理化特性以及纯化目的，来选择合理的分离纯化方法。

操作方法

包含体蛋白质的提取和纯化

简介

在利用大肠埃希菌表达重组蛋白时，经常会得到包含体。包含体分离纯化难度大，只有在变性后才能形成可溶性的形式予以纯化。纯化后的变性蛋白质需要重新复性（renaturation），才能折叠成正确的天然构象和恢复原有的生物活性。

原理

包含体是细胞感染病毒后胞浆或核中出现的特殊结构。 常用于病毒病的诊断。 根据病毒种类，包含体表现大小不一，形态各异，单一或多个，嗜酸或嗜碱。 它代表着病毒粒子的合成场所，故又称病毒工厂（virus factory）或病毒原质体（viroplasma）。包含体分离纯化难度大，只有在变性后才能形成可溶性的形式予以纯化。纯化后的变性蛋白质需要重新复性（renaturation），才能折叠成正确的天然构象和恢复原有的生物活性。

材料与仪器

试剂：
溶菌酶、EDTA、Tris、去垢剂 Triton X-100、尿素
仪器：
超声破碎仪、离心机、凝胶层析柱、透析袋

步骤

（一）裂菌、洗涤及溶解
1．裂菌利用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法裂解细菌。细菌裂解后，5000～20000 g 离心 15 分钟，可以使大多数包含体沉淀，与可溶性蛋白分离开。
2．洗涤为了弃除包含体上黏附的杂质，通常用低浓度的变性剂，如含 2mol/L 尿素的 1 mmol/LEDTA（50 mmol/L Tris，pH7.0～8.5）洗涤。过高浓度的尿素或盐酸胍会使包含体溶解。温和的去垢剂 Triton X-100 和脱氧胆酸也可以弃除膜碎片和膜蛋白。
3．溶解利用 6～8 mol/L 尿素或 5～8 mol/L 盐酸胍将包含体溶解。盐酸胍是强于尿素的变性剂。
（二）变性蛋白质的复性
1．复性过程蛋白质在尿素浓度为 4 mol/L 时开始复性，到 2 mol/L 时复性结束。对于盐酸胍而言，从浓度为 4 mol/L 开始复性，到 1.5 mol/L 时复性结束。常用的包含体蛋白质复性方法有疏水层析柱复性和凝胶层析柱复性两类。凝胶层析柱复性均用 Sephacryl S-100 或 Superdex 75 等层析介质，层析柱的长度为 40～100 cm。层析柱复性回收率高（高达 90% 以上）、速度快、易于放大、样品稀释倍数小（一般 5 倍左右）。
2．复性效率蛋白质复性取决于蛋白质本身的特性以及所处的环境。有些蛋白非常容易复性，如牛胰 RNA 酶的复性效率可以达到 95% 以上，但有一些蛋白至今还没有发现能够使其复性到天然构象的理想方法。纯化白细胞介素-2 时，以 SDS 溶液中加入铜离子（0.05% SDS，7.5～30 μmol/L CuCl2）的方法，25～37 ℃ 下反应 3 小时，再用 1 mmol/L EDTA 终止反应，复性后的二聚体低于 1%。一般说来，蛋白质的复性效率应在 20% 左右。
3．影响复性效率的因素复性缓冲液的最适 pH 是 8.0～9.0，最适温度为 4 ℃，复性时间一般为 24～36 小时。复性时的蛋白质浓度应该控制在 0.1～0.5 mg/ml，过高的浓度会影响到复性。在磁力搅拌下，逐滴将变性的蛋白质加入复性液中，使变性的蛋白质在复性缓冲液中始终处于低浓度状态。如果过快地将变性蛋白质加入到复性缓冲液中，容易形成絮状沉淀，这是蛋白质重新凝聚的前兆。
复性完毕后，蛋白质要装入透析袋，在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析 12～24 小时；透析不能太快；透析前后均要离心。
4．提高包含体蛋白复性产率的方法在包含体蛋白质复性过程中，加人促进剂可以增加折叠复性中间体的溶解性，导致形成稳定的、具有正确天然结构的蛋白质。
（1）添加氧化交换系统：对于含有二硫键的蛋白，复性过程通过氧化交换系统可以促使不正确的二硫键配对发生快速交换反应，从而提高了正确配对的二硫键的产率。常用的氧化交换系统有谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）、DTT/GSSG 等，其中 GSH/GSSG 最为常用。通常使用 1～3 mmol/L 还原型巯基试剂，还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为 10:1～5:1。
（2）添加小分子化合物：小分子化合物通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率，如盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂。蛋白质的辅助因子 Zn^＋ 或 Cu^＋ 可以稳定蛋白质的折叠中间体，防止蛋白质的聚集。浓度大于 0.4 mol/L 的 Tris 缓冲液可提高包含体蛋白质的折叠效率，浓度为 0.4～0.6 mol/L 的 L-Arg 有助于增加复性中间产物的溶解度。硫代甜菜碱类物质（non-detergent sulfobetaines，NDSBs）是近年来出现的可促进蛋白复性的新家族，NDSBs 由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短的疏水基团组成，不属于去垢剂，易于透析去除。目前常用的有 NDSB-195，NDSB-201 和 NDSB-256。
（3）添加分子伴侣和折叠酶：研究得比较透彻的分子伴侣有 Hsp60/GroE 和 Hsp70/DnaK。折叠酶包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰辅氨酰顺反异构酶等。但这类蛋白在折叠复性后要除去，而且十分昂贵，因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。

膜蛋白的提取和纯化

简介

膜蛋白在生物进程中具有关键性的作用。它们参与细胞与细胞之间、细胞与细胞基质之间的相互联系胞器及细胞的形成过程，各种离子、代谢产物和蛋白质的跨质膜运输、RNA 的跨核膜运输等。鉴于膜蛋白在多种细胞功能中的重要性，目前针对各种疾病的药物约有 50% 都以其为靶点。膜蛋白嵌在细胞膜中，水溶性不好，因此，分离和纯化膜蛋白的方法也有所不同。

原理

1. 先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。（例如：michael11 液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集 37% 与 41% 间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白）
2. 用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难. 在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定. 去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤. 虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂. 这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题. 如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠. 许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂. 然而，他们并不是普遍适用的. 在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质。如 triton X-100 在 280nm 处有吸收，如果某蛋白质的测试与 280 nm 处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂。
将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来. 这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入. 使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（＜ 5000 Da）要多。一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足 0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用 4 度时所有的蛋白质原则上都溶于 TritonX114 水溶液，在温度超过 20 度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。
3. 膜蛋白色谱 (Chromatography of Membrane Protein, CMP)CMP⁺ 分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如 SDS）溶解膜蛋白后形成 SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS 结合量有关。利用原子散射法研究 cAMP 的分离机制发现，样品与 SDS 结合后在离子交换柱上存在 SDS 分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。
4. 顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用 Tris 碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的 pellet 用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。
5.centrifugal protein extraction 原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心。

用途

分离纯化膜蛋白

材料与仪器

试剂：
PBS、NaCl、Tris(pH8.0)、MgCl2、EDTA、β-巯基乙醇、TritonX-100
仪器：
超声破碎仪、离心机

步骤

1．细胞破碎后通过梯度离心得到含有膜蛋白的粗组分利用超声破碎法的聚体步骤如下：将胰酶消化后的细胞于 1500r/min 离心 10 分钟，收集细胞沉淀，PBS 洗 3 次。加入细胞裂解液 ［10 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris(pH8.0)、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L β-巯基乙醇、0.2% Triton X-100］，冰浴 20 分钟，超声波处理 5 分钟，然后于 2500 r/min 离心 10 分钟，取上清。32 000 g 离心 30 分钟，将沉淀用 1 ml PBS 重悬，- 40 ℃ 保存。
2．用特殊的去垢剂进行选择性的分离原则上，所有蛋白质在 4 ℃ 时都溶于 Triton X-114 水溶液。但在 37 ℃ 时，此溶液分为水相和去垢剂相：亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去垢剂相中。具体步骤是：将 Triton X-114 水溶液于 4 ℃ 下离心 5 分钟（10000 g）；37 ℃ 水浴 10 分钟以分离水相和去垢剂相，然后于 37 ℃ 下离心 5 分钟（2000 g）；用 500 ml 冰冷的缓冲液 ［10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA（PH7.5）］ 溶解去垢剂相沉淀，冰浴 2 分钟后加温至 37 ℃，再次离心 5 分钟（2000 g）；加入 500 ml 冰冷的缓冲液再次抽提去垢剂相。

注意事项

去垢剂的选择通常是依据对蛋白质的提取效率以及后续的纯化步骤来确定。得到纯化的膜蛋白后，最终需要去除去垢剂。但这常常会引起蛋白质失活。如果蛋白质是用于测序的，这不是问题。如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水柱。许多文献中都介绍了多种可用来溶解膜蛋白的去垢剂，但它们并不是普遍适用的。在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质，例如 Triton X-100 在 280 nm 处有吸收，如果某蛋白质的测试与 280 nm 处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂。