简介

层析（chromatography）也称色谱，是利用蛋白质在流动相和固定相中分配不同的原理进行蛋白质分离纯化的方法。由于蛋白质理化特性的不同（分子形状、大小、极性及亲和力等），当蛋白质溶液流经固定相时，不同的蛋白质就会以不同强度的作用力结合在固定相上，实现蛋白质的分离。目前，用于蛋白质的层析纯化的方法主要有 4 种：凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和疏水作用层析。

原理

层析的实验原理是利用蛋白质在流动相和固定相中分配不同的原理进行蛋白质分离纯化的方法。由于蛋白质理化特性的不同（分子形状、大小、极性及亲和力等），当蛋白质溶液流经固定相时，不同的蛋白质就会以不同强度的作用力结合在固定相上，实现蛋白质的分离。

应用

蛋白质分离

操作方法

离子交换层析

简介

离子交换层析（ion exchange chromatography, IEC）是依据流动相中不同蛋白质与离子交换树脂上电荷基团可逆结合力的差异进行分离的。离子交换树脂是一类不溶于水的、惰性的、带有某种电荷基团的高分子聚合物凝胶颗粒。

原理

离子交换层析（ion exchange chromatography, IEC）的基本原理是依据流动相中不同蛋白质与离子交换树脂上电荷基团可逆结合力的差异进行分离的。
1. 离子交换树脂的种类：葡聚糖离子交换树脂以 Sephadex G-25 和 G-50 为基质；琼脂糖离子交换树脂以 Sepharose CL-6B 为基质。聚苯乙烯离子交换树脂的基质是苯乙烯和二乙烯苯合成的颗粒，具有机械强度大和流速快的特点，但是具有较强的疏水性，容易引起蛋白质变性，故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。
2．离子交换树脂的离子交换特性：离子交换树脂分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂带负电，可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型。一般而言，结合了磺酸基团（- SO，H），如磺酸甲基（SM）、磺酸乙基（SE）的为强酸型离子交换树脂；结合磷酸基团（- PO，H2）、亚磷酸基团（- PO2 H2）或- 0 - PO2 H2 基团的为中等酸型离子交换树脂；结合酚羟基（- OH）或羧基（- COOH）的为弱酸型离子交换树脂，如羧甲基（CM）。强酸型离子交换树脂对 H＊的结合力比 Na^＋ 小，弱酸型离子交换树脂对 H＇的结合力比 Na＊大。
阴离子交换树脂带正电，可以交换阴离子物质。同样可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型。一般结合季铵基团 ［- N（CH3）3］ 的为强碱型离子交换树脂；结合叔铵 ［- N（CH3）2］、仲铵（- NHCH3）、伯铵（- NH2）等的为中等或弱碱型离子交换树脂；结合二乙基氨基乙基（DEAE）的为弱碱型离子交换树脂。强碱型离子交换树脂对 OH 的结合力比 CI 小，而弱酸型离子交换树脂对 OH 的结合力比 CT 大。
3．离子交换树脂的交换容量：交换容量（exchange capability）反映了离子交换树脂与溶液中蛋白质进行交换的能力。它不仅与所用的离子交换树脂有关，还与实验条件密切相关，一般又称为有效交换容量。如无特殊说明，均指有效交换容量。离子交换树脂的总交换容量用每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（meq/mg 或 meq/ml）来表示。对分离蛋白质的离子交换树脂来说，通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示。

材料与仪器

试剂：
N_aO_H 和 HCI、洗脱液
仪器：
离子交换柱

步骤

离子交换层析的基本过程可分为如下几步：
1．离子交换树脂的选择离子交换树脂的选择决定于目的蛋白的电荷性质。蛋白质通常呈两性电离特性，它们与离子交换树脂的结合与它们的性质以及溶液的 pH 密切相关。
以阳离子交换树脂分离蛋白质为例，在等电点 pl＜pH 的条件下，蛋白带负电，不能与阳离子交换树脂结合；而等电点 pl＞pH 的蛋白带正电，能与阳离子交换树脂结合。一般 pI 越大的蛋白与离子交换树脂结合力越强。强型离子交换树脂使用的 pH 范围很广，所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端 pH 溶液中解离且较稳定的物质。
交换树脂基质的疏水性会影响目的蛋白的稳定性和分离效果。在分离生物大分子时，应选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都较温和，不易破坏生物大分子的活性。
2．离子交换层析柱的制备离子交换层析柱的制备可参照凝胶过滤层析柱的制备，不同的是离子交换层析柱的长度远比凝胶过滤层析柱短。离子交换树脂使用前，需要用蒸馏水除去杂质，并以 N_aO_H 和 HCI 处理树脂，使树脂上的官能基团得到完全露出。阴离子交换树脂先以 15 倍于树脂量的 0.5 mol/L HCI 浸泡 30～120 分钟，再用水清洗至 pH7.0，之后用 0.5mol/L NaOH 浸泡 30～120 分钟，同样以水清洗至 pH 7.0，最后浸泡在上样缓冲液中。阳离子交换树脂用 15 倍于树脂量的 0.5 mol/L N_aO_H 浸泡 30～120 分钟，以水清洗至 pH7.0，之后用 0.5 mol/L HCI 浸泡 30～120 分钟，再以水清洗至 pH7.0，最后浸泡在上样缓冲液。
3．缓冲液的制备若目的蛋白带正电荷，例如细胞色素 C 等碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂；而肝素和核酸等酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换树脂。此外，还要考虑蛋白质在稳定的 pH 范围内带有何种电荷，然后决定交换剂的选择。
4．加样上样时应注意样品液的离子强度和 pH。上样量应由交换容量决定，不宜过大。一般以柱床体积的 1%～5% 为宜，这样，样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。
5．洗脱
（1）洗脱液：离子交换层析中均采用线性梯度洗脱。在洗脱过程中，逐步增大离子强度，从而使与离子交换树脂结合的各个蛋白质组分被依次洗脱下来。改变 pH 的洗脱，对于阳离子交换树脂一般是 pH 从低到高洗脱，阴离子交换树脂则是 pH 从高到低洗脱。洗脱液的选择首先要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离蛋白质组分都是稳定的，其次是要使结合在离子交换树脂上的所有待分离蛋白质组分都能够被洗脱下来。缩小梯度范围可以提高分辨率。
（2）洗脱速度：通常保持恒定洗脱速度。洗脱速度慢可以有较好的分辨率，但有分离时间长、样品扩散、谱峰变宽等副作用。如果洗脱峰相对集中于某个区域，则应缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。
6．离子交换柱的再生对使用过的离子交换树脂进行处理可使其恢复原来的性状，通常的处理方法是酸碱交替浸泡。对离子交换树脂处理的目的是为了使离子交换树脂带上所需的平衡离子。

常见问题

影响交换容量的因素主要有两个：
一个是离子交换树脂的颗粒大小和颗粒内孔隙大小。这主要影响离子交换树脂中能与样品组分进行作用的有效表面积，表面积越大，交换容量越高。对于小分子来说，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可以自由进入孔隙；对于较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，因为小颗粒的离子交换树脂可以提供较大的表面积。
另一个影响因素是离子强度和 pH，它们可以影响样品中组分和离子交换树脂的带电性质。pH 对弱酸和弱碱型离子交换树脂影响较大。
例如，弱酸型离子交换树脂在 pH 较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低 pH 时，电荷基团不易解离，交换容量小。pH 还会影响到样品组分的带电性，尤其是对蛋白质这样的两性物质而言。
一般来说，离子强度增大，交换容量下降。增大离子强度进行洗脱，就是通过降低交换容量将结合在离子交换树脂上的样品组分洗脱下来。

亲和层析

简介

亲和层析（affinity chromatography）是蛋白质分离纯化最有效的方法之一，在个别情况下，仅此一步纯化即可得到高纯度的目的蛋白。

原理

亲和层析的基本原理是基于生物分子与层析柱上的配体发生特异性可逆结合的原理。亲和层析的最大特点是特异性强、简便和高效，对含量少又不稳定的活性生物分子更为有效。但是，亲和层析有一定的局限性，且成本较高。

用途

亲和层析的最大特点是特异性强、简便和高效，对含量少又不稳定的活性生物分子更为有效。

材料与仪器

试剂：
0.15 mol/L N_aC_l 的磷酸缓冲液或 0.1～0.2 mol/L Tris 缓冲液（样品缓冲液）、 抑菌剂：0.5% 乙酸氯已定（乙酸洗必泰）或 0.05% 苯甲醇
仪器：
亲和层析柱

步骤

亲和层析的基本过程可分为如下几步：
1．亲和层析柱的制备首先根据固定相配体的吸附能力和目的蛋白的含量计算装柱体积，一般用量应是计算用量的 2～3 倍。例如，用于谷胱甘肽巯基转移酶（GST）亲和层析纯化的还原型谷胱甘肽偶联的琼脂糖凝胶颗粒 1 ml 可以结合 10 mg GST 蛋白，若要纯化 5 mg 目的蛋白，则用 1 ml 还原型谷胱甘肽偶联的琼脂糖凝胶颗粒装柱。亲和层析柱的装柱方法与离子交换层析法基本相同。
2．样品上样样品一般是溶在含有 0.15 mol/L N_aC_l 的磷酸缓冲液或 0.1～0.2 mol/L Tris 缓冲液（样品缓冲液）中，以减少配体与蛋白质之间的非特异性结合。为了增加蛋白质与配体的结合，上样时应用低流速，也可以循环重复，还可将亲和层析凝胶颗粒与样品直接混合，在 4 ℃ 下搅拌过夜，然后再装柱。
3．目的蛋白的洗脱和收集洗脱之前，要用至少 10 倍柱床体积的样品缓冲液去除未结合的杂质，一般以流出液的 A280 值达到基线为佳，流速为 1 ml/min。目的蛋白的洗脱可以分为特异性洗脱和非特异性洗脱。前者是洗脱液中含有与目的蛋白竞争结合在树脂颗粒配体的底物，例如，结合于谷胱甘肽偶联的琼脂糖凝胶颗粒的 GST 蛋白可以用谷胱甘肽竞争使 GST 蛋白被洗脱。后者是通过改变盐浓度、pH、温度或使用非离子去垢剂等，使目的蛋白与配体的结合能力下降，洗脱出目的蛋白。这种洗脱方式的具体操作与离子交换层析法类似。在亲和层析中，尤其是利用抗原做配体时，往往需要利用酸性缓冲液（最常用的是 pH2.5 的甘氨酸-盐酸缓冲液）洗脱目的抗体。在这种情况下，需要以最快的速度用碱性溶液（如 1.0 mol/L 的 Tris）将洗脱液的 pH 值调回到中性，以防止目的蛋白变性失活。一般应该在实验前做好对洗脱液进行中和的预实验，明确在一定体积的洗脱液中加入多少体积的中和用溶液，以便在收集洗脱液后迅速加入。
4．亲和层析柱的再生和保存亲和层析树脂颗粒价格较昂贵，使用后应该仔细清洗、再生后按照说明保存。柱的清洗可以用高浓度的特异性洗脱液，也可以用高浓度的非特异性洗脱液，如 0.5～1.0 mol/L N_aC_l。但是盐浓度不宜过高，否则会改变蛋白质的构象、破坏配体或改变它的活度及改变配体对样品的结合能力等。清洗过的亲和层析柱储存在 8 ℃ 以下，应防止凝胶冻结。可加抑菌剂，如 0.5% 乙酸氯已定（乙酸洗必泰）或 0.05% 苯甲醇。