简介

葡萄糖经历糖酵解（glycolysis）的 10 步代谢反应，生成酮酸，然后进一步生成乳酸，或者进入线粒体脱羧成为乙酰辅酶 A（CoA），进入柠檬酸循环。在葡萄糖无氧氧化生成乳酸的代谢途径中，有 4 个关键酶决定着反应速度和方向，即己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶－1（phosphofructokinase－1，PFK－1）、 丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）和乳酸脱氢酶（lacticdehydrogenase，LDH）。重要的产物是丙酮酸和乳酸。

无氧氧化途径中关键酶和重要产物测定实验就是在葡萄糖无氧氧化生成乳酸的代谢途径中产生的关键酶和产物。

目前关于无氧氧化途径中关键酶和重要产物测定的方法主要有 6 种：HK1 活性测定、PFK－1 活性测定、PK 活性测定、LDH 活性测定、丙酮酸含量测定和乳酸含量测定。

原理

无氧氧化途径中关键酶和重要产物测定的基本原理是在葡萄糖无氧氧化生成乳酸的代谢途径中产生的关键酶和产物，可通过比色分析法，利用分光光度计或酶标仪进行检测。

操作方法

HK1 活性测定

简介

测定己糖激酶活性对于了解细胞糖代谢的状态具有重要意义。 HK 是葡萄糖分解代谢途径中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为葡萄糖－6－磷酸。HK 共有 4 种同工酶，目前的研究主要集中于 HK I 和 HK II。葡萄糖－6－磷酸是糖酵解、磷酸戊糖途径、糖原合成和糖异生等代谢过程的交叉点。

原理

HK1 活性测定的基本原理是葡萄糖和 ATP 在 HK 催化下生成葡萄糖－6－磷酸和 ADP；在葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PDH）催化下和存在氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）时，生成葡萄糖－6－磷酸内酯和还原型 NADP（NADPH）。在 NADP 充足的条件下，NADPH 的含量变化与葡萄糖－6－磷酸含量变化成正比。由于 NADPH 在 340nm 处有最大吸收峰，检测 NADPH 的吸光度变化可反映出 HK 的活性。

材料与仪器

1、细胞样品或组织样品

2、细胞裂解液

3、生理盐水

步骤

HK1 活性测定的基本过程可分为如下几步：

① 细胞样品：收集细胞到离心管内，弃上清，按照每 10° 个细胞加入 200 μl 细胞裂解液，充分匀浆，8000 g 离心 10 分钟，取上清，置冰上待测；

② 组织样品：按每 10 mg 组织加入 100 μl 生理盐水的比例进行匀浆，4 ℃、8000 g 离心 10 分钟，取上清，置冰上待测；

③ 血清（浆）样品可直接进行检测。所有样品均应避免反复冻融而影响酶的活性。

注意事项

① 不同细胞、组织的 HK 活性差异较大，需进行预实验确定测量参数和样品稀释程度；

② NADPH 的分析受温度影响较大，检测反应液的温度必须保持 37 ℃ 恒温；

③ 某些试剂需要低温保存，避免变性和失活。