简介

细胞可溶性蛋白质是指一些能够溶于水或水溶液的细胞内蛋白质分子。目前，用于细胞可溶性蛋白质的含量测定的方法主要有三种：蛋白质的电泳染色分析、蛋白质的免疫印迹法分析和蛋白质分子的流式细胞术分析。

原理

细胞可溶性蛋白质的含量测定实验的基本原理是根据可溶性蛋白的分类以及待测蛋白质的性质选择不同的方法进行定量，例如，利用基因工程方法获得的细菌可溶性重组蛋白质，常采用蛋白质电泳染色对其表达水平进行初步分析，待蛋白纯化后再直接测定蛋白质的含量；对于真核细胞内的可溶性蛋白质，可通过蛋白质免疫印迹等方法对细胞裂解物或单细胞中的目的蛋白质进行相对定性定量分析。

操作方法

电泳染色分析测定细胞可溶性蛋白质含量

简介

蛋白质的电泳染色分析是用电泳技术将混合液中不同的蛋白质分离开，通过蛋白质染色明确某种蛋白质的相对含量的技术。电泳分离血浆蛋白，染色并计算清蛋白和球蛋白的比例是此法的最早应用。

原理

电泳染色分析测定细胞可溶性蛋白质含量的基本原理是电泳技术将混合液中不同的蛋白质分离开，通过蛋白质染色明确某种蛋白质的相对含量得到这种蛋白质在总蛋白中所占比例。蛋白质染色方法包括考马斯亮蓝 R-250 染色法、银染色法（silver staining）、氨基黑 10B 染色法和丽春红 S（ponceau S）染色法等。其中前两种方法主要用在电泳胶的染色，后几种方法主要用在固定于硝酸纤维素膜或其他蛋白转移膜上的蛋白质染色。

材料与仪器

器材：离心机、电泳仪、薄层扫描仪 试剂： ①SDS-PAGE 上样缓冲液 ②0.25％ 考马斯亮蓝 R-250 染色液

步骤

电泳染色分析测定细胞可溶性蛋白质含量基本过程可分为如下几步，本方法以大肠埃希菌表达人肿瘤坏死因子 TNF-α 为例说明其基本操作。

A. 取 100μl 诱导表达后的细菌培养液，离心去上清，用 PBS 洗涤一次

B. 在菌体沉淀中加入 SDS-PAGE 上样缓冲液50μl，振荡使菌体完全悬浮，95℃ 加热 3 分钟

C. 离心，将 25μl 上清加到 SDS-PAGE 胶的样品槽中进行电泳分离

D. 电泳后用 0.25％ 考马斯亮蓝 R-250 染色液染色 2～4 小时后脱色

E. 最后在薄层扫描仪上扫描并计算出目的蛋白在总蛋白中所占的百分比（图10-6）

免疫印迹法分析测定细胞可溶性蛋白质含量

简介

免疫印迹法（immunoblotting）是对蛋白质混合溶液中目的蛋白进行定性的方法，也是对目的蛋白在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量进行半定量的方法。印迹技术最初用于核酸分子检测，后来人们发现蛋白质在电泳分离之后也可以转移并固定于膜上，因此该方法也用于蛋白质的定性定量分析。相对应于分析 DNA 的 Southern 印迹和分析 RNA 的 Northern 印迹（见第六章），蛋白质印迹被称为 Western blotting。由于其利用的是抗原-抗体结合的方法检测目的蛋白质，故也被称为免疫印迹技术。

原理

免疫印迹法分析测定细胞可溶性蛋白质含量的原理和过程与 DNA 和 RNA 印迹技术类似。蛋白质混合物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小进行分离后，在电场中蛋白质分子从凝胶转移到 NC 膜或其他膜上，各个蛋白质条带的相对位置保持不变。然后采用特异性抗体检测目的蛋白质的含量。免疫印迹技术的基本流程如图 10-7 所示。  

用途 免疫印迹技术主要用于检测样品中特定蛋白质的存在，并进行半定量分析。商品化抗体种类的大量增加以及一些特殊抗体的商品化扩大了免疫印迹技术的应用，例如多种抗磷酸化蛋白质抗体的发展使得用免疫印迹技术分析细胞信号转导过程中的蛋白质磷酸化变得十分容易。蛋白质印迹反应已经成为细胞信号转导研究中应用最广泛的技术。另外，蛋白质分子间的相互作用研究也依赖于免疫印迹技术。

材料与仪器

器材：离心机、离心管、蛋白质转移装置 试剂： ①5xSDS-PAGE 样品缓冲液 ②电转移缓冲液 ③蒸馏水 ④去离子水 ⑤含有 SDS 和巯基乙醇的缓冲液 ⑥1% NP-40 裂解缓冲液: 1% NP-40, 50mmol/L Tris-HCl (pH 7 .4), 150mmol/L NaCl,0.1mmol/L PMSF, lμmol/L pepstatin,0.5mg/ ml leupeptin , 0.3μmol/L aprotinin 。 ⑦溴酚蓝指示剂 ⑧TBST (TBS（Tris buffered saline）/0.1 % Tween 20) 溶液 ⑨ECL 反应液(A 液和 B 液等体积混合后立即使用）

步骤

免疫印迹法分析测定细胞可溶性蛋白质含量基本过程可分为如下几步，本方法以检测培养细胞内的色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）的表达状态为例说明免疫印迹检测技术的全过程。 A.细胞裂解物的制备：PEDF 位于细胞质，为检测细胞中PEDF的表达情况，需将细胞裂解（实验流程 10-3），释放细胞内容物，提取细胞的总可溶性蛋白。有多种裂解细胞的方法可供使用（表 10-3），可根据实验目的与实验条件进行选择。

在组织和细胞裂解过程中要特别注意蛋白质的降解问题。为此，可以在裂解缓冲液中加入多种蛋白酶抑制剂，并保持低温操作（表 10-4）。当采用 SDS-PAGE 样品缓冲液直接煮沸裂解时，由于操作时间很短和 SDS 对蛋白质（包括蛋白酶）的强烈变性作用，可以不用蛋白酶抑制剂。

B.细胞裂解物的蛋白定量：取 15μl 上清，利用前述的蛋白质定量微量法测定蛋白含量。如果浓度过高，可按比例稀释。 C.细胞裂解物的 SDS-PAGE：制备 SDS-PAGE 胶。取出相当于 10～50μg 蛋白的细胞裂解上清液，用 1xSDS-PAGE 样品缓冲液对各个样品体积差进行补齐，保证所有样品上样的蛋白质总质量和体积一致，最后加入四分之一体积的 5xSDS-PAGE 样品缓冲液，95℃ 加热 3min，快速离心使蒸发到管壁的水分沉到管底。每个样品取出 25μl 进行上样，同时在另外泳道内加入预染色的蛋白质分子量标准。在凝胶上加 8V／cm电压，待指示剂溴酚蓝进入分离胶后将电压提高到 10V／cm，直至指示剂前沿到达胶的底部，关掉电源。 D.蛋白质的电转移：电转移是指在电场中蛋白质从凝胶转移到转移膜上的过程，目前主要有两种电转移模式，一种是湿法，一种是半干法。两种方法均使用滤纸和海绵将凝胶和膜夹在中间制成“三明治”结构进行电转印，其区别在于所使用电转移缓冲液的体积、是否需要预冷系统以及电转移时间等。这两种方法转移效率都较高，因此常根据实验习惯以及所用设备选择电转移方法。 目前常用的转移膜有 3 种，分别是硝酸纤维素膜（NC 膜）、PVDF 膜以及尼龙膜，各种膜的特点见表 10-5。

电转移缓冲液（取Tris碱 3.03g、甘氨酸 14.41g、甲醇 200ml，加水至 1 000ml）需提前一天配制并保存于 4℃，蛋白质电泳完成以后，剥离凝胶并用蒸馏水短暂冲洗，将凝胶至于电转移缓冲液中平衡 10min，按照图 10-8 依次装好胶和转移膜。如使用 PVDF 膜，需先将膜浸入微量的 100％甲醇中数秒，直至整张膜变得半透明，用去离子水漂洗 PVDF 膜，放入电转移缓冲液中平衡 3～5min。NC膜直接浸润到电转移缓冲液中即可，浸泡大约 5min即可进行电转移。转移的时间与使用的电流有关，可以高电流快速在1h内完成转移，也可以在低电流下过夜。使用高电流时需要冷却转移装置。

E.目的蛋白的检测：在早期蛋白质印迹实验中，第二抗体主要使用 1251 标记，操作繁琐不便。20世纪90年代以后，人们改进了酶标第二抗体的检测技术，采用了更为敏感的底物显色、化学发光和荧光底物来显示目的蛋白的有无和所在位置，大大推动了蛋白质印迹技术的普遍应用（表 10-6）。

在上述方法中，综合敏感度和操作程序，较佳的方法是采用增强化学发光（enhancedchemiluminescence，ECL）的方法。ECL检测目的蛋 白的效果取决于目的蛋白丰度以及抗体的特异性、亲和力和效价。ECL法检测细胞裂解液中目的蛋白的主要步骤（实验流程10-4）包括：封闭（blocking）转移膜的非特异结合位点；目的蛋白与特异性抗体或称第一抗体（primary antibody）结合；特异抗体与抗抗体或称第二抗体（secondary antibody）结合；底物化学发光及显影。

在上述方法中，综合敏感度和操作程序，较佳的方法是采用增强化学发光（enhancedchemiluminescence，ECL）的方法。ECL检测目的蛋 白的效果取决于目的蛋白丰度以及抗体的特异性、亲和力和效价。ECL 法检测细胞裂解液中目的蛋白的主要步骤（实验流程 10-4）包括：封闭（blocking）转移膜的非特异结合位点；目的蛋白与特异性抗体或称第一抗体（primary antibody）结合；特异抗体与抗抗体或称第二抗体（secondary antibody）结合；底物化学发光及显影。

为比较不同样品的目的蛋白含量，可以将反应结果进行薄层扫描，比较各区带的峰面积；也可以在计算机扫描后，用相应软件计算不同区带信号的强弱。经一种抗体检测过的蛋白质转移膜要妥善保存。用含有 SDS 和巯基乙醇的缓冲液在 68℃ 洗涤转移膜 30min，可以去除已经结合的抗体，而原本转移到膜上的蛋白损失却很小，因此可以再次用于另一种目的蛋白的检测。

注意事项

注意事项：

1. 免疫印迹技术所测定的不是目的蛋白的绝对含量，而只能确定该目的蛋白存在与否及在可比条件下该蛋白的含量是高还是低。由于信号的强弱受多种因素的影响，所以一般仅作为半定量指标。不同目的蛋白由于所用的检测抗体不同，其含量也不具有可比性。 2. 比较一种目的蛋白在不同细胞或者同一细胞不同条件下的相对含量时，各样品的总蛋白量必须相同，只有这样所获结果才具有可比性。所以各个样品上样前要进行总蛋白浓度的测定，经过换算保证每个蛋白质样品的上样量一致是免疫印迹进行定量的前提。转移完成后，用可逆染色剂如丽春红 S 染色，确认转移是否完全以及不同样品间的蛋白质含量是否平衡。最后，使用一些细胞中管家基因表达的蛋白质，如肌动蛋白（β-actin）、微管蛋白（tublin）等作为内参照，对目的蛋白含量进行标准化（图 10-9）。

3. 蛋白质 SDS-PAGE 电泳的上样量不应过大。蛋白质上样量过大一方面导致蛋白质在电泳中分离效果降低；另一方面，如果超出了电转移膜的容量会导致最后获得的印迹信号降低。在过量蛋白质存在的条件下，蛋白质分子与膜的结合力较弱，而与后续抗体更容易结合，但是形成的抗原-抗体复合物很容易在实验过程中被洗脱下来。另外，为了达到较好的分离效果，应该选用适当浓度的凝胶进行 SDS-PAGE 电泳。 4. 开始电泳和转移前，一定要确认电极的正负极接头是否正确，以免损失样品。 5. 甲醇能够固定聚丙烯酰胺凝胶，并去除 SDS，同时提高蛋白质分子与膜的结合力，但是它能够降低大分子蛋白的移动效率。在电转移缓冲液中不加甲醇不会引起任何副反应，但是这种方法已被经验性地确定下来。目前也有许多甲醇含量较低或者不含甲醇的电转移缓冲液。另外，甲醇对非 SDS 凝胶或等电聚焦凝胶是不必要的。 6. 电转移时间由丙烯酰胺浓度、胶的厚度、凝胶的缓冲体系以及蛋白分子大小以及形状所决定。一般电转移时间太长，小分子量蛋白容易穿透转移膜而丢失；电转移时间过短，因大分子量蛋白质的转移效率有限，导致电转移效率降低，所以应该根据具体的实验设计选择不同孔径的转移膜以及电转移时间。 7. 碱性 pH 值和 SDS 更有利于蛋白质从凝胶上分离，但是酸性环境和甲醇则促进蛋白质同带负电荷的膜吸引。SDS 凝胶上的蛋白质分子因为带有 SDS 分子，导致其电转移速度快于非SDS凝胶。所以对于大分子蛋白质分子，向电转移缓冲液中加入适当 SDS（最大浓度为 0.1％）时，使蛋白质分子带负电荷，易于从凝胶洗脱，以提高电转移效率。 8. 在免疫检测中，要注意充分封闭非特异结合位点。目前较常用的是5％～10％的脱脂奶粉和牛血清白蛋白。 9. 如抗体反应在封口塑料袋内进行，一定要驱除袋内的所有气泡，否则会导致抗体结合不均匀，影响结果的正确性。 10. 操作始终要轻柔，接触胶和膜时都要戴手套，不要在转移膜上造成任何刮痕或磨痕（否则会造成背景信号）。在整个操作过程中，转移膜要始终在液体中，不能干燥。如果 PVDF 膜在使用过程中干燥，可以用甲醇重新湿润后使用。已经负载有蛋白质的转移膜以及已经干燥的 PVDF 膜也能够用甲醇重新湿润后进行目的蛋白检测。

流式细胞术分析测定细胞可溶性蛋白质含量

简介

流式细胞术（flowcytometry assay，flow cytometry，FCM）是一种定量分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞内特异标记的荧光信号，从而测定细胞的多种生化物质（如膜蛋白、抗原、离子或 DNA／RNA 水平等）性质的方法，同时也是一项可以把具有相同荧光信号特征的某些细胞亚群从多细胞群体分离出来的细胞分析技术。

原理

流式细胞术分析测定细胞可溶性蛋白质含量的基本原理是将待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料或者含有荧光染料标记的抗体染色后加入样品管中。细胞进入流动室，在液压下单列排列形成单细胞流，与水平方向的激光光束垂直相交，被标记的细胞在激光下发出特定波长的荧光、能够为光电倍增管检测到，根据荧光强度以及荧光类型对细胞中蛋白表达水平进行定量分析。

材料与仪器

器材：离心机、离心管电泳仪、流式细胞仪 试剂： ①PBS (含10％灭活正常山羊血清、0.0002％ Triton X-100 和 0.01％NaN₃) ②甲醇 ③针对目的蛋白的第一抗体工作液 ④FITC 标记的第二抗体 ⑤RNA 酶 ⑥PI

步骤

流式细胞术分析测定细胞可溶性蛋白质含量基本过程可分为如下几步：

A.细胞的收集与固定：将待测细胞彻底弃去培养液，用PBS清洗；加入消化液消化细胞，血清终止反应；收集细胞悬液，4℃、100g 离心 10 分钟，离心前留出小部分细胞进行细胞计数；离心结束后，弃去上清，将细胞重悬于 100μl PBS 中，随后加入900μl 预冷（-20℃）的甲醇固定细胞，并将细胞保存于 -20℃。

B.第一抗体结合：将 1.5x106 个上述固定的细胞转移至新的微量离心管中，于 4000g 离心 15 秒，收集细胞；弃去固定液，用1.0ml 4℃ 预冷的 PBS 重悬细胞，重复上述离心步骤；去除 PBS ，加入 0.5ml 针对目的蛋白的第一抗体工作液，轻柔振荡混匀。将细胞与抗体于 4℃ 孵育过夜。

C.染色：4000g 离心 15 秒，收集细胞，弃去抗体孵育液。用 0.5ml PBS（含10％灭活正常山羊血清、0.0002％ Triton X-100和0.01％NaN₃）重悬细胞沉淀，并轻柔混匀再离心重悬细胞以洗去未结合的第一抗体，重复洗涤3次；向细胞沉淀中加入 0.5mlFITC 标记的第二抗体并轻柔混匀，37℃ 孵育 2 小时，期间间断性轻柔混匀并尽可能避光；重复洗涤步骤 2～3 次，并弃去上清；向细胞沉淀中加入 0.5mlRNA酶并轻柔混匀，37℃ 孵育 30 分钟。

D.样品上机分析：加入 0.5ml PI（DNA染色），使溶液体积为 1ml，轻柔混匀。用 40～60μm 的尼龙膜过滤细胞，上机并进行数据分析。

注意事项

1. 所有的液体溶液和试剂都应通过高压消毒或者过滤除菌的方式灭菌，并无菌保存。

2. 消化收集细胞时仔细控制细胞消化时间，避免细胞成团

3. 每个样品的起始细胞数至少为 1.5x10°，在固定和染色过程中会损失一些细胞，最后上机检测时细胞数大约为 1.0x10。减小离心管容积，并使用聚丙烯管能够减少细胞流失。

4. 清洗溶液中可加入山羊血清以降低抗体的非特异性结合。

5. 调整固定液的量能够改变细胞的浓度。使用甲醇作为固定液时，PBS和甲醇的最佳体积比为 1：9。对于一些蛋白质分子在不同的固定条件常得出不同的结果。已经固定的细胞可以在 -20℃放置1年以上，不会引起抗原丢失。

6. 在用流式细胞术确定抗体稀释度之前，应该先采用免疫荧光方法明确第一抗体以及第二抗体的稀释度。为确定第一抗体是否过量，使用相同第一抗体稀释液处理两组样品（除第一抗体外，这两组样品的其他处理应该是完全一致的），顺次进行流式细胞仪检测，对比荧光信号结果，如果第一抗体稀释度过高，第二个样品发出的荧光信号将明显弱于第一个样品。

7. 在流式细胞术实验过程中，应该严格控制离心条件，一方面尽量减少丢失细胞，另一方面将机械剪切力对细胞的损伤降到最低。