简介

分泌蛋白（secreted protein）是指在细胞内合成后，分泌到细胞外起作用的蛋白质，如消化酶、体液中的部分蛋白成分、抗体和部分激素等。因为分泌蛋白质常存在于成分复杂的体液中，如消化液、血液以及细胞培养的上清中，而且蛋白浓度常相对较低，所以需要使用灵敏度高、特异性好的方法进行分泌蛋白的含量测定。目前，用于细胞可溶性蛋白质的含量测定的方法主要有两种：免疫印迹法和酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

原理

免疫印迹法测定细胞分泌蛋白质含量的基本原理是蛋白质进行免疫印迹之前通过物理或化学的方法使待测样品中的所有蛋白质成分沉淀，一方面去除各种糖、脂质和离子成分的影响，保证电泳效果；另一方面浓缩蛋白质，避免出现假阴性结果。混合物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小进行分离后，在电场中蛋白质分子从凝胶转移到 NC 膜或其他膜上，各个蛋白质条带的相对位置保持不变。然后采用特异性抗体检测目的蛋白质的含量。免疫印迹技术的基本流程如图 10-7 所示。

酶联免疫吸附剂测定细胞分泌蛋白质含量的基本原理是 ELISA 借助酶标记的抗体或抗原在体外与固相化的抗原或抗体相结合，固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定比例。加入底物显色系统，通过酶与底物的相互作用呈现颜色反应，反应颜色的深浅与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

操作方法

免疫印迹法测定细胞分泌蛋白质含量

简介

免疫印迹法（immunoblotting）是对蛋白质混合溶液中目的蛋白进行定性的方法，也是对目的蛋白在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量进行半定量的方法。印迹技术最初用于核酸分子检测，后来人们发现蛋白质在电泳分离之后也可以转移并固定于膜上，因此该方法也用于蛋白质的定性定量分析。相对应于分析 DNA 的 Southern 印迹和分析 RNA 的 Northern 印迹（见第六章），蛋白质印迹被称为 Western blotting。由于其利用的是抗原-抗体结合的方法检测目的蛋白质，故也被称为免疫印迹技术。

原理

免疫印迹法测定细胞分泌蛋白质含量的基本原理是蛋白质进行免疫印迹之前通过物理或化学的方法使待测样品中的所有蛋白质成分沉淀，一方面去除各种糖、脂质和离子成分的影响，保证电泳效果；另一方面浓缩蛋白质，避免出现假阴性结果。混合物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小进行分离后，在电场中蛋白质分子从凝胶转移到NC膜或其他膜上，各个蛋白质条带的相对位置保持不变。然后采用特异性抗体检测目的蛋白质的含量。免疫印迹技术的基本流程如图10-7所示。

材料与仪器

器材：离心机、离心管、蛋白质转移装置 试剂： ①5xSDS-PAGE 样品缓冲液 ②电转移缓冲液 ③蒸馏水 ④去离子水 ⑤含有SDS和巯基乙醇的缓冲液 ⑥1% NP-40 裂解缓冲液： 1 % NP-40, 50mmol/L Tris-HCl (pH 7 .4), 150mmol/L NaCl,0.1mmol/L PMSF, lμmol/L pepstatin,0.5mg/ ml leupeptin , 0.3μmol/L aprotinin 。 ⑦溴酚蓝指示剂 ⑧TBST (TBS（Tris buffered saline）/0.1 % Tween 20) 溶液 ⑨ECL 反应液(A 液和 B 液等体积混合后立即使用）

步骤

免疫印迹法分析测定细胞分泌蛋白质含量基本过程与测定细胞可溶性蛋白相似，可分为如下几步，本方法以检测培养细胞内的色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）的表达状态为例说明免疫印迹检测技术的全过程。

A.细胞裂解物的制备：PEDF 位于细胞质，为检测细胞中 PEDF 的表达情况，需将细胞裂解（实验流程10-3），释放细胞内容物，提取细胞的总可溶性蛋白。有多种裂解细胞的方法可供使用（表10-3），可根据实验目的与实验条件进行选择。

在组织和细胞裂解过程中要特别注意蛋白质的降解问题。为此，可以在裂解缓冲液中加入多种蛋白酶抑制剂，并保持低温操作（表10-4）。当采用 SDS-PAGE 样品缓冲液直接煮沸裂解时，由于操作时间很短和 SDS 对蛋白质（包括蛋白酶）的强烈变性作用，可以不用蛋白酶抑制剂。

B. 盐析沉淀或者低温有机溶剂沉淀法沉淀总蛋白，一方面去除各种糖、脂质和离子成分的影响，保证电泳效果；另一方面浓缩蛋白质，避免出现假阴性结果。利用硫酸按沉淀分离纯化蛋白的具体实验操作指导供参考。

硫酸按的加入有如下几种方法： CD 加入固体盐法：用于饱和度较高而不增大溶液体积的情况；

＠）加入饱和溶液法： 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；

＠透析平衡法：先将样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铁溶液中进行透析，透析袋内硫酸按饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。

C细胞裂解物的蛋白定量：取 15μl 蛋白质混合溶液，利用前述的蛋白质定量微量法测定蛋白含量。如果浓度过高，可按比例稀释。

D.细胞裂解物的 SDS-PAGE：制备 SDS-PAGE 胶。取出相当于 10～50μg 蛋白的细胞裂解上清液，用 1xSDS-PAGE 样品缓冲液对各个样品体积差进行补齐，保证所有样品上样的蛋白质总质量和体积一致，最后加入四分之一体积的 5xSDS-PAGE 样品缓冲液，95℃ 加热 3 分钟，快速离心使蒸发到管壁的水分沉到管底。每个样品取出 25μl 进行上样，同时在另外泳道内加入预染色的蛋白质分子量标准。在凝胶上加 8V／cm 电压，待指示剂溴酚蓝进入分离胶后将电压提高到 10V／cm，直至指示剂前沿到达胶的底部，关掉电源。

E.蛋白质的电转移：电转移是指在电场中蛋白质从凝胶转移到转移膜上的过程，目前主要有两种电转移模式，一种是湿法，一种是半干法。两种方法均使用滤纸和海绵将凝胶和膜夹在中间制成“三明治”结构进行电转印，其区别在于所使用电转移缓冲液的体积、是否需要预冷系统以及电转移时间等。这两种方法转移效率都较高，因此常根据实验习惯以及所用设备选择电转移方法。

目前常用的转移膜有 3 种，分别是硝酸纤维素膜（NC膜）、PVDF 膜以及尼龙膜，各种膜的特点见表 10-5。

电转移缓冲液（取 Tris 碱 3.03g、甘氨酸 14.41g、甲醇 200ml，加水至 1000ml）需提前一天配制并保存于 4℃，蛋白质电泳完成以后，剥离凝胶并用蒸馏水短暂冲洗，将凝胶至于电转移缓冲液中平衡 10 分钟，按照图 10-8 依次装好胶和转移膜。如使用 PVDF 膜，需先将膜浸入微量的 100％ 甲醇中数秒，直至整张膜变得半透明，用去离子水漂洗 PVDF 膜，放入电转移缓冲液中平衡3～5 分钟。NC膜直接浸润到电转移缓冲液中即可，浸泡大约 5 分钟即可进行电转移。转移的时间与使用的电流有关，可以高电流快速在 1 小时内完成转移，也可以在低电流下过夜。使用高电流时需要冷却转移装置。

F.目的蛋白的检测：在早期蛋白质印迹实验中，第二抗体主要使用 1251 标记，操作繁琐不便。20 世纪 90 年代以后，人们改进了酶标第二抗体的检测技术，采用了更为敏感的底物显色、化学发光和荧光底物来显示目的蛋白的有无和所在位置，大大推动了蛋白质印迹技术的普遍应用（表 10-6）。

在上述方法中，综合敏感度和操作程序，较佳的方法是采用增强化学发光（enhancedchemiluminescence，ECL）的方法。 ECL检测目的蛋白的效果取决于目的蛋白丰度以及抗体的特异性、亲和力和效价。ECL 法检测细胞裂解液中目的蛋白的主要步骤（实验流程 10-4）包括：封闭（blocking）转移膜的非特异结合位点；目的蛋白与特异性抗体或称第一抗体（primary antibody）结合；特异抗体与抗抗体或称第二抗体（secondary antibody）结合；底物化学发光及显影。

为比较不同样品的目的蛋白含量，可以将反应结果进行薄层扫描，比较各区带的峰面积；也可以在计算机扫描后，用相应软件计算不同区带信号的强弱。经一种抗体检测过的蛋白质转移膜要妥善保存。用含有 SDS 和巯基乙醇的缓冲液在 68℃ 洗涤转移膜 30 分钟，可以去除已经结合的抗体，而原本转移到膜上的蛋白损失却很小，因此可以再次用于另一种目的蛋白的检测。

注意事项

免疫印迹法也可以用于分泌蛋白的定性定量分析，但是不能单独使用。原因是：

①血液以及细胞培养上清的成分复杂，常含有多糖或者脂类等成分，干扰 SDS-PAGE 电泳结果，导致蛋白质混合物不能按照分子量很好地分离，致使后续结果混乱；

②如果样品中蛋白质浓度较低，免疫印迹检测很可能出现假阴性结果。所以在进行免疫印迹之前通过物理或化学的方法使待测样品中的所有蛋白质成分沉淀，一方面去除各种糖、脂质和离子成分的影响，保证电泳效果；另一方面浓缩蛋白质，避免出现假阴性结果。

酶联免疫吸附剂测定细胞分泌蛋白质含量

简介

ELISA 是酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的简称。该方法自 20  世纪 70 年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。ELISA 分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争性 ELISA，其中每种方法根据检测试剂的不同又分为一些亚类，例如直接法分为酶标抗原的直接法和酶标抗体的直接法，双抗体夹心法又分为直接双抗体夹心法和间接双抗体夹心法。

原理

酶联免疫吸附剂测定细胞分泌蛋白质含量的基本原理是 ELISA 借助酶标记的抗体或抗原在体外与固相化的抗原或抗体相结合，固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定比例。加入底物显色系统，通过酶与底物的相互作用呈现颜色反应，反应颜色的深浅与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

 

材料与仪器

器材：酶标仪、恒温培养箱 试剂： ①ELISA 检测试剂盒 ②8mol／L的尿素 ③HRP 偶联的链亲和素 ④PBS 或者含有 1％BSA 的 Tween ⑤显色终止溶液

 

步骤

酶联免疫吸附剂测定细胞分泌蛋白质含量的基本过程可分为如下几步，本方法以 PEDF 分子的 ELISA 检测试剂盒为例，介绍直接双抗体夹心法的操作步骤。

试剂盒中已含有包被了小鼠抗人 PEDF 单克隆抗体的96孔酶标板，所以省略了包被抗体的步骤。根据试剂盒说明书倍比稀释标准品，配制 0～62.5ng／ml的标准品溶液备用。

A.为排除 PEDF 同其他蛋白分子结合而不能被检测的可能性，必须采用尿素处理样品。首先使用终浓度为 8mol／L的尿素冰上处理样品 1h；采用商品化样品稀释液、PBS或者含有 1％BSA 的 Tween 以至少 1：100 的稀释度稀释样品，以降低样品中的尿素浓度，将尿素对抗原和抗体结合的影响降到最低，处理后的样品必须马上与固相化抗体相结合。

B．向酶标板中加入 100μl 标准品或者样品，标准品和样品均应做复孔，37℃ 孵育 1h。

C．洗板 4 次。

D．每孔加入 100μl 稀释好的生物素标记小鼠抗人 PEDF 单克隆抗体，37℃ 孵育 1h。

E．洗板 4 次后，每孔加入 100μl HRP 偶联的链亲和素，37℃孵育1h。

F．将显色底物平衡至室温后，取 100μl 加入到各反应孔中，室温孵育 5～10min；观察各孔颜色反应的发生情况，当最高浓度标准品（62.5ng／ml的标准品）呈现深蓝色时，每孔加入100μl显色终止溶液终止反应。此时反应液从蓝色变成黄色，立即用酶标仪在 450 nm下检测每孔的吸光度。

G.数据分析。以PEDF标准品的浓度为横坐标，各个标准品在 450nm 下的吸光度为纵坐标作标准曲线，根据待测样品的吸光度得出样品中 PEDF 的浓度。

 

 

注意事项

1.样品的获取与保存：所得样品应立即分装；立即进行实验的样品可保存于 4℃，否则应该贮存在 -80℃，避免反复冻融。可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，如体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可用于测定特定抗体或抗原成分的存在。不同样品的处理方法各不相同，可根据实验目的以及试剂盒要求进行处理。例如，细胞培养上清应离心后去除细胞碎片或细胞后再进行实验。为排除细胞培养基对结果的影响，应该使用细胞培养基配制标准品。

2.加样方法：ELISA 实验中加样的方法至关重要，除包被外，加样时移液头与管壁都需呈 45° 角加样；加样体积要准确；加样手法要轻，勿过力；微量移液器的枪头尖端不能过度碰到管底而导致其变弯，也不能加在管壁上；另外，加样时不能产生气泡，气泡会导致读数不准确。

3.洗板：ELISA 实验中洗板不完全会导致背景显色过强，干扰实验结果。目前推荐使用多通道移液器，每次每孔加入 250μl 洗液进行洗板。弃去洗液时，应倒扣酶标板、甩尽孔内液体，将板扣在吸水性好的纸巾或滤纸上，彻底去除洗液。如此重复 4 次。

4.建议每次 ELISA 实验均应重新进行标准品测定，得到新的标准曲线。

ELISA 方法因简单易行、灵敏度高、特异性好等优点被广泛用于医学诊断与研究和生物学研究等领域。但 ELISA 实验需要严格控制各个环节的操作，否则会引起背景过强、显色不完全等结果。