简介

在适宜的条件下，T7 RNA聚合酶/启动子系统表达的基因产物可占细胞总蛋白的25%以上，但多数情况下产量比这个比例要低得多。

操作方法

T7 RNA 聚合酶/启动子表达实验

材料与仪器

载体
氨苄青霉素 卡那霉素 pGP 裂解缓冲液
培养箱 分光光度计 离心机

步骤

1.  将含有待表达基因的片段亚克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，转化一种标准大肠杆菌菌株，此菌株不应带有可指导T7 RNA聚合酶合成的质粒。转化物涂布于氨苄青霉素平皿，于37℃温育培养过夜。
 
2.  挑取独立的转化菌落于LB/氨苄青霉素培养基中，37℃培养，通过小量制备方法获得质粒DNA。以限制性酶谱分析确证基因正确插入与否。 
 
3.  从pGP1-2转化大肠杆菌K38株涂布LB/卡那霉素平皿上，30℃下培养过夜（24 h）。挑取单个的转化菌落于LB/卡那霉素培养基中，30℃培养。

4.  将一含有P_t7控制下的待表达基因的载体转化入大肠杆菌K38/pGP1-2，于LB/卡那霉素培养基上生长（转化期间细胞可经热激处理），将转化物涂布于LB/氨苄青霉素/卡那霉素平板上，30℃培养过夜。

5.  挑取含两种质粒的大肠杆菌单菌落，接种于5 ml LB/氨苄青霉素/卡那霉素培养基中，30℃下培养过夜。
 
6.  按1：40比例稀释1 ml 过夜培养物，30℃下于LB/氨苄青霉素/卡那霉素培养基中长数小时，直至OD₃₉₄≈0.4。
 
7.  速将温度升高至42℃，继续培养30 min，诱导T7 RNA聚合酶基因的表达。
 
8.  将培养温度降至37℃，继续温育90 min 后，离心收集细胞。
 
9.  通SDS-聚丙烯酰胺电泳分析诱导产生的蛋白。将相当于1.0 ml 培养液中的细胞重悬于0.1 ml 裂解缓沖液中，100℃加热5 min 后，立即将各样本以每份20 μl 的量加到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。可取10 μl 细胞制备适当的细胞提取物检测诱导后的酶活性。

（T7 RNA 聚合酶/启动子表达实验）备选方案

材料与仪器

蛋白质
氨基酸混合物 M9培养基 甲硫氨酸 甲醇
荧光显微镜 离心机 分光光度计

步骤

1.  将含有待表达基因的片段亚克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，转化一种标准大肠杆菌菌株，此菌株不应带有可指导T7 RNA聚合酶合成的质粒。转化物涂布于氨苄青霉素平皿，于37℃温育培养过夜。
 
2.  挑取独立的转化菌落于LB/氨苄青霉素培养基中，37℃培养，通过小量制备方法获得质粒DNA。以限制性酶谱分析确证基因正确插入与否。 
 
3.  从pGP1-2转化大肠杆菌K38株涂布LB/卡那霉素平皿上，30℃下培养过夜（24 h）。挑取单个的转化菌落于LB/卡那霉素培养基中，30℃培养。

4.  将一含有P_t7控制下的待表达基因的载体转化入大肠杆菌K38/pGP1-2，于LB/卡那霉素培养基上生长（转化期间细胞可经热激处理），将转化物涂布于LB/氨苄青霉素/卡那霉素平板上，30℃培养过夜。

5.  当OD₅₉₄≈0.4时，取1 ml 细胞，微量离心10 s。弃上清。
 
6.  用1 ml M9培养基洗细胞沉淀，室温下离心10 s，弃上清。
 
7.  用1 ml 含18种氨基酸混合物的M9培养基重悬细胞沉淀，30℃振荡培养60 min。
 
8.  细胞于42℃温育20 min，以诱导T7 RNA聚合酶，加20 mg/ml 的利福平至终浓度为200 μg/ml，然后将细胞再置于42℃温育10 min。
 
9.  将细胞移入30℃水浴中，放置20 min，取0.5 ml 细胞用于［³⁵S］甲硫氨酸标记（另外的0.5 ml 可在以后的时刻用作标记）。
 
10.  加入10 μl［³⁵S］甲硫氨酸于0.5 ml 细胞液中以标记新合成的蛋白质，30℃下温育5 min。
 
11.  离心10 s，弃上清，（注意：上清是有放射性的，应妥善处置。）用100 μl 裂解液重悬细胞。
 
12.  样品100℃加热5 min，取20 μl 加样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶中并进行电泳。
 
13.  用荧光显影增强剂处理凝胶，65℃下真空干燥凝胶2 h，进行放射自显影。

（T7 RNA 聚合酶/启动子表达实验）备选方案2

材料与仪器

噬菌体
PEG IPTG
培养箱 离心机

步骤

1.  制备从M13噬菌体mGP1-2原种，加PEG溶液沉淀浓缩噬菌体。重悬噬菌体于M9培养基，滴定其滴度。
 
2.  将由“基本方案”步骤1所得的含T7 启动子表达质粒转化M13许可性大肠杆菌细胞，转化物涂布于氨苄青霉素平皿上，37℃培养过夜。挑取独立转化菌落，接种于LB/氨苄青霉素培养基中，37℃温育过夜。 

3.  将过夜培养物以1：100比例稀释于LB/氨苄青霉素培养基中，37℃缓缓振荡培养至OD₅₉₀≈0.5（避免剧烈振荡）。

4.  从步骤1得到的M13噬菌体mGP1-2以每细胞感染约10个噬菌体的量，感染大肠杆菌，加100 mmol/l IPTG至终浓度为1 mmol/l，诱导T7 RNA聚合酶表达。37 ℃下温育细胞2 h。
 
5.  通SDS-聚丙烯酰胺电泳分析诱导产生的蛋白。将相当于1.0 ml 培养液中的细胞重悬于0.1 ml 裂解缓沖液中，100℃加热5 min 后，立即将各样本以每份20 μl 的量加到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。可取10 μl 细胞制备适当的细胞提取物检测诱导后的酶活性。

6.  收获细胞并分析产生的诱导蛋白。