简介

固相 pH 梯度等电聚焦（Immobilized pH gradients isoelectric focusing， IPGIEF）是 80 年代建立起来的一种新型等电聚焦技术。它利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成 pH 梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，从而形成固定的，不随环境电场等条件变化的 pH 梯度。本实验来源「蛋白质电泳实验技术」主编：郭尧君。

操作方法

制胶

原理

固相 pH 梯度凝胶是由固相 pH 梯度介质（丙烯酰胺衍生物）共价结合到聚丙烯酰胺凝胶中并形成 pH 梯度，所以制胶过程比载体两性电解质凝胶复杂。灌胶的方法与常规聚丙烯酰胺梯度凝胶和 SDS 梯度凝胶相似。高质量的凝胶介质和固相 pH 梯度介质，聚合过程以及漂洗对固相 pH 梯度凝胶是非常重要的。

材料与仪器

丙烯酰胺单体贮液 过硫酸铵贮液
灌胶模具

步骤

1. 选择 pH 范围，计算缓冲与滴定 Immobiline 的体积

对未知样品 pH 范围的选择，最好先用宽范围（如 pH 3.5~10 ) 载体两性电解质等电聚焦确定其等电点的位置，再选择窄范围的固相 pH 梯度等电聚焦。确定范围后，根据表 7.4 和 7.5 査得或进一步用内插法计算得到缓冲和滴定 Immobiline 的体积。

2. 贮液配置

丙烯酰胺单体贮液：溶解 14.55 g 丙烯酰胺和 0.45 g N,N'-甲叉双丙烯酰胺在 35 ml 双蒸水中，搅拌直至溶解，用双蒸水加至 50 ml。过滤，溶液可在 4℃ 保存两周。

40% (W/V) 过硫酸铵贮液：溶解 0.4 g 过硫酸铵在 1 ml 双蒸水中。溶液必须新鲜配置。

Immobiline II：使用前将贮存在 4~8℃ 冰箱中的 Immobiline II 溶液在室温平衡约 0.5 小时。

3. 模具组装和凝胶溶液的配置

如 “水平平板电泳的制胶” 组装灌胶模具，但不需要在模具上做加样孔。如欲灌注 T=5%、C=3% 的凝胶，参见表 7.4，表 7.5 和表 7.6。凝胶溶液必须新鲜配置。一般将酸性 Immobiline 作为重液，碱性 Immobiline 作为轻液，俗称 “酸重碱轻”。如欲提高电泳速度，可加 100 μl 载体两性电解质。

4. 灌胶

固相 pH 梯度的灌胶模具可使用与常规聚丙烯酰胺梯度凝胶和 SDS 梯度凝胶灌胶相同的模具，参见 “水平平板电泳的制胶” 。但不需要做加样孔，并且不需要有浓缩胶和分离胶之别。作者实验室曾灌注 pH 4.4~5.4 固相 pH 梯度胶用于分析 Gc 蛋白亚型和 pH 5.05~5.60 固相 pH 梯度凝胶用于分析转铁蛋白。

(1) 灌胶前梯度混合器的腔间阀和流出管的夹子都应关闭。

(2) 将 7.5 ml ( 视凝胶大小而定）轻液（碱性）注入梯度混合器的储液腔。小心打开腔间阀，赶去腔间气泡，再关上腔间阀。若不慎有轻液流入混合腔，则需将轻液吸回储液腔。

(3) 将同样体积的重液（酸性）注入梯度混合器的混合腔。在两个腔中分别放入同样大小的搅拌子，在储液腔中放入补偿棒，此时两腔液面应该相平。

(4) 将梯度混合器置于磁力搅拌器的最佳位置上。将流出管插入灌胶模具中央。为了控制流速，得到线性梯度，梯度混合器的出口与流出管末端高度相差约 5 cm。开动磁力搅拌器（200~500 r/min)。

(5) 在两个腔中各自先加 TEMED，再加过硫酸铵。打开流出管的夹子，当酸液流到流出管的一半时，打开腔间阀。两腔中液面同时下降，在混合腔混合后，缓缓注入垂直放置的模具中。

(6) 灌注完毕后，在室温静置 5~20 分钟（可用异丙醇封胶 )。放入 30~40℃ 烘箱中聚合。灌胶后，立即洗净梯度混合器，以免堵塞腔间阀。

5. 洗胶和吹胶

凝胶聚合约需 1 小时，从烘箱中取出凝胶模具后，同 “薄层分析等电聚焦的方法” 方法取出凝胶，标上正、负极。称重后放入双蒸水中（6X10 分钟或 3X1 小时 )，室温下振摇约 60 次/分钟，洗去催化剂和未聚合的单体。洗胶后，用软纸吸去表面的水。用冷风（小电扇）在一定距离约（50 cm ) 吹胶至与洗胶前重量相差小于 1%。如果凝胶中含有过多水，影响胶浓度和梯度，在电泳时易在凝胶表面形成水滴，改变导电性干扰聚焦。小于 pH 8 的凝胶至多可保存一周，碱性胶不宜保存。

等电聚焦（固相pH梯度等电聚焦实验）

材料与仪器

丙烯酰胺单体贮液 过硫酸铵贮液

步骤

打开循环水浴，设置冷却温度，一般为 10℃。

将制好的固相 pH 梯度凝胶铺在冷却板上，注意正负极。其间涂以液体石蜡或煤油，避免气泡陷入，以保证胶板和冷却板之间的良好接触。

用合适的电极溶液（参见表 7.7) 润湿滤纸电极条，分别放置凝胶的酸、碱侧。有的仪器采用粗电极与凝胶直接接触，不需加电极条。

按冷却板上的格子和预先设计的实验计划将样品加在凝胶上。微量样品可直接滴加，稀样品加在滤纸块上或小槽中。固相 pH 梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的样品处理方法相似，只是前者 pH 梯度已在凝胶中固定，所以样品中的盐对梯度影响不大，但过高的盐浓度也会造成凝胶电导的降低而烧胶或使谱带畸变。

将白金电极丝分别放在滤纸电极条的中心，再将阳极和阴极分别与电源的正、负极相连。接通电源，电参数参见表 7.8。

pH 梯度的测定

材料与仪器

丙烯酰胺单体贮液 过硫酸铵贮液

步骤

由于固相 pH 梯度凝胶的导电性很低，不可能用表面电极测定凝胶表面的 pH。但对于宽范围的固相 pH 梯度可以用等电点蛋白标准来测定，方法同载体两性电解质等电聚焦。但目前还没有合适的市售蛋白标准可用于测定窄范围的固相 pH 梯度。灌制凝胶时，pH 梯度范围是已知的，且梯度是线性的。故可根据凝胶两端之间距离来测算 pH 梯度和蛋白质的 pI。在灌制非线性梯度胶时，则可根据非线性梯度来计算。