简介

来源：《蛋白质组学：从序列到功能》<link />

操作方法

未解析碎片离子的检索实验

原理

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材料与仪器

蛋白样品
质谱仪

步骤

数据库同样可以检索一个单个肽段及其碎片离子的质量。肽段质量同它的碎片离子质量一起提供了非常具有鉴别力的判断标准，可用于在序列数据库中检索，包括由表达序列标签翻译的序列数据库（图 5.3) 。这一手段已被广泛用于凝胶分离蛋白质酶水斛后产生的肽段鉴定。肽段通常用上文所述的一些方法，在质谱仪气相中被诱导产生碎片离子，例如 PSD-MALDI-MS, 或三级四极质谱及离子阱中的 CID。在这些仪器中，肽段离子断裂的方式具有序列特异性，主要沿肽骨架的肽键断裂，见图 5.4 所示。

如果肽离子的正电荷保留在碎片离子的 N 末端，此离子被称为 b 系列离子，用下行数字代表这一碎片离子中的氨基酸残基数目，从 N 末端起为1 。因此， b 离子代表 C 末端缺失， N 未端完整的碎片离子。如果电荷保留在 C 末端，离子被称为 y 系列离子：与 b 系列离子一样有下标数字，但从 C 末端数起）。因此 y 离子代表N末端缺失， C 末端完整的碎片离子。 CID 谱图是由几千种独立的裂解过程产生数据的混合图，即 b 系列和 y 系列离子的混合图。谱图中也存在一些其他离子：氨基酘侧链 (Gln, Lys, Arg) 中性丢失氨、产生少 17个质量数的离子；筑基酸侧链 (Ser, Thr, Asp, Glu) 中性丢失 H₂O 产生少 18个质量单位的离子：以及从 b 系列离子中性丢失 co 产生少 28个质量范围的离子，即 a 系列离子：另外，如果一个肽段离子发生多次裂解，就会产生中间碎片，包括酰基离子 (acyl, 由至少 2个氨基酸残基组成，见图 5.4b) 和亚氨离子（见图 5.4c 和表 5.2), 亚氨离子代表单个氨基酸的质量，因此提供了肽段的部分氨基酸组成。井不是所有的肽键在 CID 条件下都具有相同的断裂倾向，在同一张 MS/MS 谱图中产生的碎片离子的强度也有显著差异。

最常发生的断裂是在脯氨酰 (prolyl) 键上，通常产生 CID 诸图中的最强离子峰，另外，不稳定的脯氨酰 (prolyl) 键断裂还导致产生了敕常见的中间碎片酰基离子 (acyl), 并从脯氨酸残基延伸到 C 末端令如上所述，肽段裂解可由 PSD- MALDI- MS 产生，也可用三级四极或离子阱质谱的CID诱导产牛。这二种方法中 由 PSD-MALDl-MS 导致的裂解最不易控制，在 PSD-MALDI-MS 中仅有的可变参数是激光通量和基质。另外，在 MALDI-MS 中只产生单电荷离子，电喷雾离子化产生的双电荷和一电荷离子相比，需要更多的能量使其断裂。因此 PSD-MALDI-MS 的成功率很低，在很多情况下，同一样品的 PSD 谱图质量比 ESI仪器的 CID 分析谱图差很多。碎片离子谱图包含有重复的信息，例如重叠的 b 和 y 系列离子以及同一肽段的多个中间离子。这种重复使碎片离子谱成为极丰富的序列特异信息来源，但也使序列的解析更加复杂，因为通常不能直接判断某一离子归属于哪一种离子系列。

注意事项

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常见问题

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未解析碎片离子的检索实验

原理

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材料与仪器

蛋白样品
质谱仪

步骤

除了人工解析碎片离子谱外，还有两种基本检索手段用于匹配数据库中序列产生的碎片离子谱。

第一种方法依靠人工解析部分谱图来鉴别某一特定系列 (b 或v) 离子的连续离子元素（例如鉴别出相互之间相差一个氨基酸残基质量的碎片离子），解析出部分序列信息，再结合以下参数：①鉴定出的系列中第一个离子的质量数；②肽段质量与最后一个离子质量之差（这两个质量数限制了此序列两端未知残基的总质量），③此完整肽段的质量，④所用蛋白水解酶的酶切持性（在 N 端 'C 端都切还是只切一端）。这五种信息组成了肽序列标签 "PST" (peptide sequence tag, PST) 。在序列数据库中可以检索出符合 PST 各元素内容的肽序列。

第二种类型的碎片离子检索程序是真正的用未解析的碎片离子信息检索的程序，称为 SEQUEST。其检索手段首先是在数据库中的每个序列中寻找与实验测量肽离子质量 致的肽段（在一定误差范围以内）、肽段质量计算值是其连续氨基酸质量之和，在检索时如有必要，还要利用蛋白酶的酶切位点特异信息。对检索到的每一个候选队，程序计算出其在相同CID 实验条件下预期产牛的碎片离子质量数。然后用簇分析算法 (cluster-analysis algorithms) 将前 500个计算值与实验测得的碎片离子谱比较。每一个比较结果都有一个得分值，报告出得分最高的结果，如果得分值有显著性意义 则蛋白质鉴定成功。此方法的鉴定基础是未经任何解析的肽段碎片离子质谱图。在数据依赖LC-MS/MS 分析中可以自动化地应用这一技术。分析过程中，肽段经反相 HPL( 分商，电喷雾进入联机质谱仪，此质谱仪可进行数据依赖的 MS/MS 分析，即将离子流超过一定阈值的所有离子打碎进行MS/MS 分析，并记录所打的谱，自动提交检索。这种自动化手段有许多优点：

(1) 复杂的蛋白质混合物可以被逐个鉴定，因为每一个做 MS/MS 分析的肽段产生的碎片离子数据都独立进人数据库检索.,

(2) 在这种类型的分析中，来自于每一个肽段的碎片离子谱都代表一个独立的数据库检索。如果一个单一的蛋白质被酶解 蛋白质鉴定结论基本上能够自动确定，因为在多肽段检索结果中，应该是同一个蛋白位于般高排位,

(3) 如上所述，这一方法的自动化程度高。

(4) 通过指导程序可以预测某一特定残基上的特定修饰，此方法适用于寻找行特定翻译后修饰的肽段，同样可以以鉴定产生这一翻译后修饰肽段的蛋白质

注意事项

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常见问题

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