简介

可逆的蛋白质的磷酸化作用参与植物细胞生理学的所有活动。由于用于研究磷酸化蛋白质的蛋白质组学和质谱技术的应用，使得这项具有高度挑战性的任务—揭示和分析植物中动态蛋白磷酸化网络的工作最近才开始成为可能的。本实验来源「植物蛋白质组学实验指南」〔法〕H.蒂勒门特、M.齐维、C.达默韦尔、V.米琴主编。

操作方法

🔥 蛋白质磷酸化

审核专家 | 赵玉洁博士

生理学 厦门大学

原理

磷酸化修饰是蛋白翻译后修饰方式之一，多发生在蛋白多肽链的苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸的羟基上，影响着蛋白活性状态，参与了机体多种生理病理过程，蛋白质磷酸化位点的鉴定和分析已成为蛋白组学研究的重要组成部分。

用途

蛋白磷酸化位点的鉴定和蛋白质磷酸化状态的分析

Western blot	利用特异的磷酸化抗体检测常规样品中的磷酸化蛋白。
ELSA（酶联免疫吸附分析）	蛋白特异性位点磷酸化的定量分析。
质谱	复杂蛋白混合物中大规模磷酸化蛋白的分析、磷酸化位点的鉴定。

材料与仪器

1、材料与仪器见 Western blot;

2、材料与仪器见 ELISA;

3、材料与仪器见原 protocol。

步骤

1、步骤见 Western blot;

2、步骤见 ELISA;

3、步骤见原 protocol。

注意事项

1、Western blot —细胞或组织样品要在含有新鲜磷酸酶抑制剂的裂解液中匀浆，样品裂解过程中需持续置于冰上或维持在 4℃；

使用 5% w/v BSA 而非脱脂奶粉封闭 PVDF 膜（牛奶中含酪蛋白，抗体会检测出导致高背景，同时酪蛋白是一种磷酸化蛋白）；磷酸化可能需要被诱导（信号弱或无信号可能意味诱导不充分，建议设置阳性对照）。

2、EILSA - 初始捕获抗体和磷酸化状态无关，目的蛋白结合在抗体包被的分析板上后加入待分析的特异性位点磷酸化检测抗体，产生的信号强弱与初始样品中特异性位点磷酸化蛋白的浓度呈正比。

3、质谱-磷酸化修饰肽段丰度相对于整体样本是很低的，有效富集磷酸化肽段能降低非磷酸化肽段形成的高背景信号；

磷酸基团取代方法中，巯基乙醇取代磷酸基团交联生物素后由亲和色谱柱分离的方法仅适用于丝氨酸和苏氨酸的磷酸化检测，而通过化学反应在磷酸基团上连接半胱胺基团，修饰的磷酸肽用固相化碘乙酰凝胶提取的方法适用于各种氨基酸的磷酸修饰。

常见问题

1、Western blot 问题

①磷酸化检测信号弱或无信号：

细胞或组织样品要在含有新鲜磷酸酶抑制剂的裂解液中匀浆，样品裂解过程中需持续置于冰上或维持在 4℃；磷酸化可能需要被诱导（信号弱或无信号可能意味诱导不充分，建议设置阳性对照）；

②背景高：

使用 5% w/v BSA 而非脱脂奶粉封闭 PVDF 膜（牛奶中含酪蛋白，抗体会检测出导致高背景，同时酪蛋白是一种磷酸化蛋白）。

2、EILSA 问题

信号强弱：

初始捕获抗体和磷酸化状态无关，目的蛋白结合在抗体包被的分析板上后加入待分析的特异性位点磷酸化检测抗体，产生的信号强弱与初始样品中特异性位点磷酸化蛋白的浓度呈正比，注意设置对照。

3、质谱问题

①影响检测准确度的因素：

磷酸化修饰肽段丰度相对于整体样本是很低的，有效富集磷酸化肽段能降低非磷酸化肽段形成的高背景信号；

②磷酸基团取代方法的选择：

磷酸基团取代方法中，巯基乙醇取代磷酸基团交联生物素后由亲和色谱柱分离的方法仅适用于丝氨酸和苏氨酸的磷酸化检测，而通过化学反应在磷酸基团上连接半胱胺基团，修饰的磷酸肽用固相化碘乙酰凝胶提取的方法适用于各种氨基酸的磷酸修饰。