简介
分子标记（molecular marker）是遗传标记（genetic marker）的一种，是在基因水平上的标记，直接在 DNA 分子上检测遗传变异，用作指示基因组范围变化的多态性标记。分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制，正是因为这些优点，分子标记的应用越来越广泛。它包括 RFLP、RAPD、AFLP、SSR 等。
长期以来，植物学研究中选择都是基于表型性状、形态学、结构等方面进行的，当性状的遗传基础较为简单或即使较为复杂但表现加性基因遗传效应时，表型选择是有效的。但物种的许多重要表型性状为数量性状，如产量等；或多基因控制的质量性状，如抗性等；或表型难以准确鉴定的性状，如根系活力等。此时根据表型提供的对性状遗传潜力的度量是不确切的，因而选择是低效的。分子生物学技术的发展为植物科学研究提供了一种基于 DNA 变异的新型遗传标记——DNA 分子标记，或简称分子标记。与传统应用的常规遗传标记相比，分子标记具有许多明显的优点，因而已被广泛应用于现代植物研究的各个方面，大量以前无法进行的研究目前利用分子标记手段正蓬勃开展，并取得了丰硕的成果。尤其是当分子标记技术与传统形态结构紧密结合后，正在为植物科学技术带来一场新的变革。
分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为 3 大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）标记、DNA 指纹（DNA fingerprinting）技术、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性 DNA（random amplification polymorphism DNA，RAPD）标记、简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）标记或简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism，SSLP）标记、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记、序标位（sequence tagged sites，STS）标记、序列特征化扩增区域（sequence charactered amplified region，SCAR）标记等；第三类是一些新型的分子标记，如单核昔酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记、表达序列标签（expressed sequences tags，EST）标记等。以下将介绍其中最常用的一些标记技术。
操作方法
同工酶标记
简介
分子标记（molecular marker）是遗传标记（genetic marker）的一种，是在基因水平上的标记，直接在 DNA 分子上检测遗传变异，用作指示基因组范围变化的多态性标记。分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制，正是因为这些优点，分子标记的应用越来越广泛。它包括 RFLP、RAPD、AFLP、SSR 等。
长期以来，植物学研究中选择都是基于表型性状、形态学、结构等方面进行的，当性状的遗传基础较为简单或即使较为复杂但表现加性基因遗传效应时，表型选择是有效的。但物种的许多重要表型性状为数量性状，如产量等；或多基因控制的质量性状，如抗性等；或表型难以准确鉴定的性状，如根系活力等。此时根据表型提供的对性状遗传潜力的度量是不确切的，因而选择是低效的。分子生物学技术的发展为植物科学研究提供了一种基于 DNA 变异的新型遗传标记——DNA 分子标记，或简称分子标记。与传统应用的常规遗传标记相比，分子标记具有许多明显的优点，因而已被广泛应用于现代植物研究的各个方面，大量以前无法进行的研究目前利用分子标记手段正蓬勃开展，并取得了丰硕的成果。尤其是当分子标记技术与传统形态结构紧密结合后，正在为植物科学技术带来一场新的变革。
分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为 3 大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）标记、DNA 指纹（DNA fingerprinting）技术、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性 DNA（random amplification polymorphism DNA，RAPD）标记、简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）标记或简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism，SSLP）标记、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记、序标位（sequence tagged sites，STS）标记、序列特征化扩增区域（sequence charactered amplified region，SCAR）标记等；第三类是一些新型的分子标记，如单核昔酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记、表达序列标签（expressed sequences tags，EST）标记等。以下将介绍其中最常用的一些标记技术。
原理
广义同工酶是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称为同工酶（isoenzyme）。同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸（mRNA），后者再翻译产生同工酶的肽链，不同的肽链可以不聚合的单体形式存在，也可聚合成纯聚体或杂交体，从而形成同一种酶的不同结构形式（图 42-1A）。
同工酶分离方法主要有电泳法、层析法、酶学法和免疫学法等，其中以电泳法应用最为广泛。其原理在于同工酶是功能相同但结构不同的一组酶，由于其结构中氨基酸序列或组成存在差异，从而使同工酶在电泳过程中，其迁移率也存在差异。乳酸脱氢酶（LDH）是研究的最多的同工酶。生物学功能：遗传的标志；和个体发育及组织分化密切相关；适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要，用电泳方法将 LDH 同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组织中有 5 条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由 4 条肽链组成的四聚体，LDH 有两类肽链，A（M）或 B（H），各有不同的免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的 5 种同工酶。LDH1 及 LDH5 分别由纯粹的 4 条 B 链（B4）和 4 条 A 链（A4）形成，称为纯聚体；而 LDH2、LDH3 和 LDH4 都是由两类肽链杂交而成的，分别可写成 AB3、A2B2、A3B，称为杂交体（图 42-lB）。
带电颗粒了在电场作用下，向着与其电荷相反的电极方向移动的现象，称为电泳（electrophoresis，EP）。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。常用的电泳有两种：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）及琼脂糖凝胶电泳，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳为垂直电场，琼脂糖凝胶电泳为水平电场。琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化 DNA 片段的标准方法。琼脂糖凝胶电泳分子置于电场中以一定速度（迁移率）移向适当电极。迁移率同电场强度、电泳分子所携带的静电荷数成正比，还与介质的摩擦系数相关。一定电场强度下 DNA 分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。琼脂糖凝胶分辨 DNA 片段的范围为 0.2~50 kb；聚丙烯酰胺凝胶分辨力为 1~1000 bp。浓度越高，孔隙越小，分辨能力越强。凝胶电泳中，加入溟化乙锭（简称 EB）染料对核酸分子染色之后，将电泳标本放置在紫外线下观察，便可以十分敏感且方便地检测出凝胶介质中 DNA 的谱带位置。
过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，因此过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。
材料与仪器
器材：
各种植物叶片材料、黄豆和蚕豆。
器具：
PCR 仪、移液枪、1.5 mL 离心管、PCR 扩增管、电泳仪、梳子、硝酸纤维素膜、尼龙膜、Bio-Rad 凝胶成像仪、垂直电泳槽、微量加样器、Tip 头、研钵、移液管、离心机。
试剂：
1 mol/L 盐酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铉、蔗糖、漠化乙锭、漠酚蓝、乙酸联苯胺溶液、过氧化氢、琼脂糖、引物、MgCl2、dNTP、Taq DNA 聚合酶、PCR Buffer 溶液、硅胶、甲酰胺、SB 缓冲液 100 bp DNA ladder、冰醋酸、AgNO3 甲醛、Na2S2O3、ddH2O。
步骤
同工酶标记的基本过程可分为如下几步：
（1）提取酶液：取蚕豆幼芽 2 个和黄豆幼芽 3 个分别置于研钵中，加入 1 mL 水研磨匀浆，然后将样品移至小离心管中离心（1000 r/min）15 min，取上清液，备用。
（2）聚丙烯酰胺凝胶系统的配制（16 mL）：
A 液：1 mol/L 盐酸 48.0 mL，Tris 36.0 g，TEMED 0.23 mL 加水至 100 mL，pH8.3。B 液：丙烯酰胺 30.0 g，甲叉双丙烯酰胺 0.8 g 加水至 100 mL。C 液：过硫酸铉（用前配制）1.4%。配胶，A：B：C：H2O = 1：2：0.4：4.6（体积比），配胶后立即灌进装胶室，插上梳子。
（3）电极缓冲液配制：Tris 3.0 g，甘氨酸 14.4 g 加水至 1000 mL，pH8.8，使用时稀释 10 倍。
（4）染色液配制（过氧化物酶染液）：乙酸联苯胺溶液 5 mL，3% H2O2 2 mL，H2O 93 mL。
（5）加样和电泳：向各加样孔中滴加 24 μL 的样品酶粗提液。加 1 小微滴 1% 漠酚蓝，在电压 120 V 下进行电泳分离，根据指示剂位置确定电泳时间。电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，用刀片或薄板轻轻将玻璃夹层分开（图 42-2）。
（6）染色：将完整的胶块置于染色器皿中，加入染色液，浸泡整块凝胶，室温下染色 20~30 min，呈现酶带后取出胶块，用水漂洗以终止染色。
（7）对带型清楚的胶应做摄影记录或做扫描测定，胶晾干后做永久保存。
（8）根据迁移率 R 值绘制同工酶酶谱及聚类分析。① 计算酶谱的相似性系数：c = 2 w/（a + b）。 其中，c 表示同工酶谱的相似系数，a 为种 A 酶谱的酶带数，b 为种 B 酶谱的酶带数，w 为 A、B 两种的相同酶带数。② 计算不相似性系数值：d = L－c。 ③ 釆用未加权配群法，即 UPGMA 法，进行聚类分析，根据结果绘岀树系图。④ 计算 Xi 值：Xi =（L + Da - Db）/2L。把不相似值总计最大的种酶谱定为a，在 X 轴上标记为 0，Xi 为所求种酶沿 X 轴对种 A 酶谱的距离;。L为种 A 的 a 与 B 的 b 之间的不相似值， Da 为种 A 的 a 与所求种酶之间的不相似值；Db 为种 B 的 b 与所求种酶之间的不相似值。经过计算得到各酶谱在 X 坐标轴上的排序，通过在轴上距离的远近，可以推测各分类群之间的亲缘关系（薛俊杰等，2000；CherreauetaL，1999；邹春静等，2003）。
限制性片段长度多态性标记
简介
分子标记（molecular marker）是遗传标记（genetic marker）的一种，是在基因水平上的标记，直接在 DNA 分子上检测遗传变异，用作指示基因组范围变化的多态性标记。分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制，正是因为这些优点，分子标记的应用越来越广泛。它包括 RFLP、RAPD、AFLP、SSR 等。
长期以来，植物学研究中选择都是基于表型性状、形态学、结构等方面进行的，当性状的遗传基础较为简单或即使较为复杂但表现加性基因遗传效应时，表型选择是有效的。但物种的许多重要表型性状为数量性状，如产量等；或多基因控制的质量性状，如抗性等；或表型难以准确鉴定的性状，如根系活力等。此时根据表型提供的对性状遗传潜力的度量是不确切的，因而选择是低效的。分子生物学技术的发展为植物科学研究提供了一种基于 DNA 变异的新型遗传标记——DNA 分子标记，或简称分子标记。与传统应用的常规遗传标记相比，分子标记具有许多明显的优点，因而已被广泛应用于现代植物研究的各个方面，大量以前无法进行的研究目前利用分子标记手段正蓬勃开展，并取得了丰硕的成果。尤其是当分子标记技术与传统形态结构紧密结合后，正在为植物科学技术带来一场新的变革。
分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为 3 大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）标记、DNA 指纹（DNA fingerprinting）技术、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性 DNA（random amplification polymorphism DNA，RAPD）标记、简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）标记或简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism，SSLP）标记、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记、序标位（sequence tagged sites，STS）标记、序列特征化扩增区域（sequence charactered amplified region，SCAR）标记等；第三类是一些新型的分子标记，如单核昔酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记、表达序列标签（expressed sequences tags，EST）标记等。以下将介绍其中最常用的一些标记技术。
原理
限制性片段长度多态性标记是以分子杂交为核心的分子标记技术，该技术由 Grodzicker 等于 1974 年创立。特定生物类型的基因组 DNA 经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子质量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP 标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段 DNA 的重组（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生 RFLP（图 42-3）。该分子标记是不依赖于 PCR 扩增的一种分子生物学研究技术。RFLP 分子标记不仅具有稳定遗传、高度共显性和多态性等特性，而且还能对不同的植物类群进行直接的差异分析比较（图 42-4）。
RFLP 标记的主要特点：① 遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；② 无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；③ 共显性，可区分纯合子和杂合子；④ 结果稳定、可靠；⑤ DNA 需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践。
RFLP 标记的优点：① 标记数目可以是无限的。RFLP 揭示的是 DNA 水平自然变异，其数目几乎是无限的。② 大部分标记为共显性：表现 RFLP 的位点一般是单一序列，每个位点通常有两个等位基因（其显性）。遵循孟德尔式遗传，因而 RFLP 标记图也可用传统的遗传图谱方法来构建。③ 任何发育期都可预测，不受环境影响。DNA 分子水平标记没有发育阶段或器官的特异性，不受环境条件及基因互作的影响。④ 高度变异性。每一植株都会有大量的多态性。通常只要有一次有性杂交，一个作图群体就能构建一个较丰富的 RFLP 图谱。
在做 RFLP 分析技术时，有几个问题需要引起密切注意：① 作为检测对象的 DNA 分子必须保持大分子，在抽提 DNA 的过程中避免人为地将 DNA 分子机械性切割成小片段，否则最终显示的 RFLP 图谱可能是一种假象。② 在用限制性内切酶消化大分子 DNA 时，要使 DNA 被完全消化，否则所得的结果也不可靠。③ 被消化的 DNA 浓度不能太高。④ 电泳时要用低压电泳。⑤ 杂交前探针必须充分变性。⑥ 要根据探针标记的情况，以及探针与靶 DNA 间序列互补的程度和 G、C 的含量来掌握杂交和洗膜的条件。⑦ 作放射自显影时，要根据杂交后膜上的放射活性等因素决定曝光的时间。
材料与仪器
器材：
各种植物叶片材料、黄豆和蚕豆。
器具：
PCR 仪、移液枪、1.5 mL 离心管、PCR 扩增管、电泳仪、梳子、硝酸纤维素膜、尼龙膜、Bio-Rad 凝胶成像仪、垂直电泳槽、微量加样器、Tip 头、研钵、移液管、离心机。
试剂：
1 mol/L 盐酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铉、蔗糖、漠化乙锭、漠酚蓝、乙酸联苯胺溶液、过氧化氢、琼脂糖、引物、MgCl2、dNTP、Taq DNA 聚合酶、PCR Buffer 溶液、硅胶、甲酰胺、SB 缓冲液 100 bp DNA ladder、冰醋酸、AgNO3 甲醛、Na2S2O3、ddH2O。
步骤
限制性片段长度多态性标记的基本过程可分为如下几步：
（1）DNA 提取（靶 DNA 的准备）：先将基因组 DNA 抽提出来，选用合适的限制性内切核酸酶酶解基因组 DNA，将酶解出来的具有各种长度的 DNA 片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将 DNA 片段变性后转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，称印迹（Southern blot）转移，并在 80 ℃ 烘烤或用长波紫外线照射，将 DNA 固定在膜上。
（2）核酸探针的标记：将准备作为探针的 DNA 片段纯化（这些 DNA 片段可以是基因组 DNA 的一个片段，或是 cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如 a-32P）或非放射性元素（如 Dig-dUTP 等）标记，经纯化后再用。探针的获得是最先用内切酶处理植物的 DNA 获得 DNA 片段，再将其重组到质粒上，使它能插入细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段 DNA 的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化 DNA 片段的过程称为 DNA 克隆。这一系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。
（3）杂交显示：将标记好的探针与硝酸纤维素膜或尼龙膜上的单链核酸杂交，洗膜去除未杂交的标记探针后，进行放射自显影或加入酶的底物进行显色反应，再对显示出来的谱带进行分析。
随机扩增多态DNA标记
简介
分子标记（molecular marker）是遗传标记（genetic marker）的一种，是在基因水平上的标记，直接在 DNA 分子上检测遗传变异，用作指示基因组范围变化的多态性标记。分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制，正是因为这些优点，分子标记的应用越来越广泛。它包括 RFLP、RAPD、AFLP、SSR 等。
长期以来，植物学研究中选择都是基于表型性状、形态学、结构等方面进行的，当性状的遗传基础较为简单或即使较为复杂但表现加性基因遗传效应时，表型选择是有效的。但物种的许多重要表型性状为数量性状，如产量等；或多基因控制的质量性状，如抗性等；或表型难以准确鉴定的性状，如根系活力等。此时根据表型提供的对性状遗传潜力的度量是不确切的，因而选择是低效的。分子生物学技术的发展为植物科学研究提供了一种基于 DNA 变异的新型遗传标记——DNA 分子标记，或简称分子标记。与传统应用的常规遗传标记相比，分子标记具有许多明显的优点，因而已被广泛应用于现代植物研究的各个方面，大量以前无法进行的研究目前利用分子标记手段正蓬勃开展，并取得了丰硕的成果。尤其是当分子标记技术与传统形态结构紧密结合后，正在为植物科学技术带来一场新的变革。
分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为 3 大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）标记、DNA 指纹（DNA fingerprinting）技术、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性 DNA（random amplification polymorphism DNA，RAPD）标记、简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）标记或简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism，SSLP）标记、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记、序标位（sequence tagged sites，STS）标记、序列特征化扩增区域（sequence charactered amplified region，SCAR）标记等；第三类是一些新型的分子标记，如单核昔酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记、表达序列标签（expressed sequences tags，EST）标记等。以下将介绍其中最常用的一些标记技术。
原理
随机扩增多态 DNA 标记由 Williams 等于 1990 年创立。其基本原理与 PCR 技术一致。PCR 技术是一种体外快速扩增特异基因或 DNA 序列的方法，由 Mullis 等于 1985 年首创。该技术在试管中建立反应体系，经数小时后，就能将极微量的目的基因或某一特定的 DNA 片段扩增数百万倍。其原理与细胞内发生的 DNA 复制过程相类似，首先是双链 DNA 分子在邻近沸点的温度下加热时分离成两条单链 DNA 分子，然后 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，并利用反应混合物中的 4 种脱氧核昔三磷酸（dNTP）合成新生的 DNA 互补链，以上过程为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，经过 20~30 个循环后，介于两个引物间的特异 DNA 片段以几何数级得以大量复制。RAPD 标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般 8~10 个碱基）非定点地扩增基因组 DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组 DNA 如果在特定引物结合区域发生 DNA 片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致 PCR 产物增加、缺少或发生分子质量变化。若 PCR 产物增加或缺少，则产生 RAPD 标记。随机扩增多态性 DNA 分子标记，简称 RAPD 标记，常常呈共显性遗传。应用 RAPD 技术进行品种纯度鉴定，方法简单、快捷、可靠，不需要任何前期 DNA 模板信息。对于任一特定的 RAPD 引物，即随机引物在模板的两条链上有互补的位置，且引物的 3，端相距在一定的长度范围之内，就可以扩增出来 DNA 片段。通过对 PCR 产物的检测分析即可以测出基因组在这些区域的多态性（图 42-5）。
RAPD 标记的主要特点：① 不需 DNA 探针，设计引物也无需知道序列信息。② 技术简便，检测速度快；不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。③ DNA 样品需要量少，引物价格便宜，成本较低。④ 不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析。
RAPD 标记缺点：① RAPD 标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子。②存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度 DNA 片段，而不能分开那些长度相同但碱基序列组成不同的 DNA 片段。③ RAPD 标记技术中影响因素很多，因此实验的稳定性和重复性差，结果可靠性较低。
材料与仪器
器材：
各种植物叶片材料、黄豆和蚕豆。
器具：
PCR 仪、移液枪、1.5 mL 离心管、PCR 扩增管、电泳仪、梳子、硝酸纤维素膜、尼龙膜、Bio-Rad 凝胶成像仪、垂直电泳槽、微量加样器、Tip 头、研钵、移液管、离心机。
试剂：
1 mol/L 盐酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铉、蔗糖、漠化乙锭、漠酚蓝、乙酸联苯胺溶液、过氧化氢、琼脂糖、引物、MgCl2、dNTP、Taq DNA 聚合酶、PCR Buffer 溶液、硅胶、甲酰胺、SB 缓冲液 100 bp DNA ladder、冰醋酸、AgNO3 甲醛、Na2S2O3、ddH2O。
步骤
（1）选择16株植物新鲜叶片样品，通过40条随机引物的RAPD-PCR实验，筛选出理想的随机引物（表42-1）。
|
名称 |
序列5'一3' |
名称 |
序列5'一3' |
名称 |
序列5'一3' |
名称 |
序列5'一3' |
|
A01 |
CACK1CCCTTC |
A11 |
CAATCGCCGT |
D01 |
ACCGCGAAGG |
D11 |
AGCGCCATTG |
|
A02 |
TGCCGAGCTG |
A12 |
TCGGCGATAG |
D02 |
GGACCCAACC |
D12 |
CACCGTATCC |
|
A03 |
AGTCAGCCAC |
A13 |
CAGCACCCAC |
D03 |
GTCGCCGTCA |
D13 |
GGGGTGACGA |
|
A04 |
AATCGGGCTG |
A14 |
TCTGTGCTGG |
D04 |
TCTGGTGAGG |
D14 |
CTTCCCCAAG |
|
A05 |
AGGGGTCTTG |
A15 |
TTCCGAACCC |
D05 |
TGAGCGGACA |
D15 |
CATCCGTGCT |
|
A06 |
GGTCCCTGAC |
A16 |
AGCCAGCGAA |
D06 |
ACCTGAACGG |
D16 |
AGGGCGTAAG |
|
A07 |
GAAACGGGTG |
A17 |
GACCGCTTGT |
D07 |
TTGGCACGGG |
D17 |
TTTCCCACGG |
|
A08 |
GTGACGTAGG |
A18 |
AGGTGACCGT |
D08 |
GTGTGCCCCA |
D18 |
GAGAGCCAAC |
|
A09 |
GGGTAACGCC |
A19 |
CAAACGTCGG |
D09 |
CTCTGGAGAC |
D19 |
CTGGGGACTT |
|
A10 |
GTGATCGCAG |
A20 |
GTTGCGATCC |
D10 |
GGTCTACACC |
D20 |
ACCCGGTCAC |
资料来源：赵鹏等，2012b。
（2）对 16 株叶片进行基因组 DNA 提取。
（3）在 20 μL 的反应体系中加入以下物质：模板DNA 2μL，随机引物1 μmol/L，10 × PCR Buffer 2.0 μL，MgCl2 2.5 mmol/L，dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）各 0.25mmol/L，Taq 聚合酶 0.5 U。混匀稍离心（引物见表42-1）o
（4）在加热至 90 ℃ 以上的 PCR 仪中 95 ℃ 预变性 3 min，然后循环：94 ℃，40 s；36 ℃，1 min，72 ℃，2 min，共 30 个循环。
（5）循环结束后，72 ℃，10 min进行延伸，4 ℃保存。
（6）取PCR产物 5 μL 加 1 μL 上样缓冲液（6×）于 2% 琼脂糖凝胶上电泳，稳压 100 V。
（7）电泳结束，观察、拍照（图 42-6）。
（8）根据 RAPD 扩增结果计算：遗传相似性系数 S = 2Nxy/（Nx + Ny），Nxy 为种间共有的扩增带，Nx 为 X 种具有的扩增带，Ny 为 Y 种具有的扩增带；遗传距离（D）：D = 1 - S。
暂无评论内容