简介

植物叶绿体色素含量直接影响植物的光合作用和作物产量，还与植物水分与矿质营养的供应、逆境条件和植物衰老密切相关。叶绿体含量也是反映叶片的生长、发育情况的重要生理指标。本实验学习并掌握叶绿体色素的定量测定方法。

原理

叶绿体色素的定量测定的基本原理是根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度c和液层厚度L成正比，即：

A = kcL    （14-1）

式中：A一消光度；

c一溶质浓度；

L—液层厚度；

k一比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1 cm 时，为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数，可测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而 求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和，这就是消光度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a、叶绿素 b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在 3 个特定波长下的吸光度 A ，并根据叶绿素 a、叶绿素 b 及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a、叶绿素 b 时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素 a、叶绿素 b 的 80% 丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663 nm 和 645 nm，又知在波长 663 nm 下，叶绿素 a、叶绿素 b 在该溶液中的比吸收系数分别为 82.04 和 9.27，在波长 645 nm 下分别为 16.75 和 45.60，可根据加和性原则列岀以下关系式：

A₆₆₃ = 82.04 c_a + 9.27 c_b    （14-2）

A₆₄₅ = 16.75 c_a + 45.60 c_b    （14-3）

式中：A₆₆₃、A₆₄₅—叶绿素溶液在波长 663 nm 和 645 nm 时的消光度；

c_a、c_b一叶绿素 a 和叶绿素 b 的浓度，mg・L^-1_。

解方程组（14-2）、（14-3）得：

c_a = 12.72 A₆₆₃ - 2.59 A₆₄₅    （14-4）

c_b = 22.88 A₆₄₅ - 4.67 A₆₆₃    （14-5）

将c_a 与 c_b 相加即得叶绿素总量c_T

c_T = c_a + c_b = 20.29 A₆₄₅ + 8.05 A₆₆₃    （14-6）

另外，由于叶绿素 a、叶绿素 b 在 652 nm 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为 34.5），也可以在此波长下测定一次消光度（A₆₅₂）而求出叶绿素 a、叶绿素 b 总量：

c_T =（A₆₅₂ × 1 000）/34.5    （14-7）

在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。Li-chten-thaler 等对 Arnon 法进行了修正，提出了 80% 丙酮提取液中 3 种色素含量的计算公式：

c_a = 12.21 A₆₆₃ - 2.81 A₆₄₆    （14-8）

c_b = 20.13 A₆₄₆ - 5.03 A₆₆₃    （14-9）

c_x._c =（1 000 A₄₇₀ - 3.27 c_a - 104 c_b）/229    （14-10）

式中：c_a、c_b—叶绿素 a、b 的浓度；

c_x._c一类胡萝卜素的总浓度；

A₆₆₃、A₆₄₅ 和 A₄₇₀—叶绿体色素提取液在波长 663 nm、646 nm 和 470 nm 下的消光度。由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时计算公式也有所不同。叶绿素 a、叶绿素 b 在 95% 乙醇中最大吸收峰的波长分别为 665 nm 和 649 nm，类胡萝卜素为 470 nm，可据此列出以下关系式：

c_a = 13.95 A₆₆₅ - 6.88 A₆₄₉    （14-11）

c_b = 24.96 A₆₄₉ - 7.32 A₆₆₅    （14-12）

c_x._c =（1 000 A₄₇₀ - 2.05 c_a - 114.8 c_b）/245    （14-13）

操作方法

叶绿体色素的定量测定

简介

植物叶绿体色素含量直接影响植物的光合作用和作物产量，还与植物水分与矿质营养的供应、逆境条件和植物衰老密切相关。叶绿体含量也是反映叶片的生长、发育情况的重要生理指标。本实验学习并掌握叶绿体色素的定量测定方法。

原理

叶绿体色素的定量测定的基本原理是根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度c和液层厚度L成正比，即：

A = kcL    （14-1）

式中：A一消光度；

c一溶质浓度；

L—液层厚度；

k一比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1 cm 时，为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数，可测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而 求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和，这就是消光度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a、叶绿素 b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在 3 个特定波长下的吸光度 A ，并根据叶绿素 a、叶绿素 b 及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a、叶绿素 b 时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素 a、叶绿素 b 的 80% 丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663 nm 和 645 nm，又知在波长 663 nm 下，叶绿素 a、叶绿素 b 在该溶液中的比吸收系数分别为 82.04 和 9.27，在波长 645 nm 下分别为 16.75 和 45.60，可根据加和性原则列岀以下关系式：

A₆₆₃ = 82.04 c_a + 9.27 c_b    （14-2）

A₆₄₅ = 16.75 c_a + 45.60 c_b    （14-3）

式中：A₆₆₃、A₆₄₅—叶绿素溶液在波长 663 nm 和 645 nm 时的消光度；

c_a、c_b一叶绿素 a 和叶绿素 b 的浓度，mg・L^-1_。

解方程组（14-2）、（14-3）得：

c_a = 12.72 A₆₆₃ - 2.59 A₆₄₅    （14-4）

c_b = 22.88 A₆₄₅ - 4.67 A₆₆₃    （14-5）

将c_a 与 c_b 相加即得叶绿素总量c_T

c_T = c_a + c_b = 20.29 A₆₄₅ + 8.05 A₆₆₃    （14-6）

另外，由于叶绿素 a、叶绿素 b 在 652 nm 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为 34.5），也可以在此波长下测定一次消光度（A₆₅₂）而求出叶绿素 a、叶绿素 b 总量：

c_T =（A₆₅₂ × 1 000）/34.5    （14-7）

在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。Li-chten-thaler 等对 Arnon 法进行了修正，提出了 80% 丙酮提取液中 3 种色素含量的计算公式：

c_a = 12.21 A₆₆₃ - 2.81 A₆₄₆    （14-8）

c_b = 20.13 A₆₄₆ - 5.03 A₆₆₃    （14-9）

c_x._c =（1 000 A₄₇₀ - 3.27 c_a - 104 c_b）/229    （14-10）

式中：c_a、c_b—叶绿素 a、b 的浓度；

c_x._c一类胡萝卜素的总浓度；

A₆₆₃、A₆₄₅ 和 A₄₇₀—叶绿体色素提取液在波长 663 nm、646 nm 和 470 nm 下的消光度。由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时计算公式也有所不同。叶绿素 a、叶绿素 b 在 95% 乙醇中最大吸收峰的波长分别为 665 nm 和 649 nm，类胡萝卜素为 470 nm，可据此列出以下关系式：

c_a = 13.95 A₆₆₅ - 6.88 A₆₄₉    （14-11）

c_b = 24.96 A₆₄₉ - 7.32 A₆₆₅    （14-12）

c_x._c =（1 000 A₄₇₀ - 2.05 c_a - 114.8 c_b）/245    （14-13）

材料与仪器

材料：新鲜植物叶片或其他绿色组织或干材料。

试剂：

① 95% 乙醇（或 80% 丙酮）
② 石英砂
③ 碳酸钙粉

器材：

① 分光光度计
② 研钵
③ 剪刀
④ 玻璃棒
⑤ 棕色容量瓶
⑥ 小漏斗
⑦ 定量滤纸
⑧ 吸水纸
⑨ 擦镜纸
⑩ 滴管
⑪ 电子天平

步骤

叶绿体色素的定量测定的基本过程可分为如下几步：

1. 取新鲜植物叶片（或其他绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2. 称取剪碎的新鲜样品 0.2 g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及 2~3 ml 95% 乙醇（或 80% 丙酮）研成匀浆，再加乙醇 10 ml，继续研磨至组织变白，静置 3~5 min.

3. 取滤纸 1 张，置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到 25 ml 棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至 25 ml，摇匀。

5. 把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以 95% 乙醇为空白，在波长 665 nm、649 nm 和 470 nm 下测定吸光度。

6. 按公式（14-11）、（14-12）、（14-13）［如用 80% 丙酮，则按公式（14-8）、（14-9）、（14-10）] 分别计算叶绿素 a、b 和类胡萝卜素的浓度（mg・L^-1），公式（14-11）、（14-12）计算结果相加即得叶绿素总浓度。

7. 求得色素的浓度后，测定结果记入表 14-1。再按下式计算组织中各色素的含量［用每 克鲜重或干重叶片的叶绿素含量(mg)表示］。

注意事项

1. 为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。

2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在 710 nm 或 750 nm 波长下测量光密度，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时光密度值的 5%，否则应重新过滤。

3. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差 1 nm，则叶绿素 a 的测定误差为 2%，叶绿素 b 为 19%，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素 a 和 b 来校正。