小鼠肺支气管肺泡灌洗分析炎症细胞浸润—科研工具箱

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原文来自:JoVE Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration | Protocol

0:05 标题

0:52 支气管肺泡灌洗 (BAL)

2:58 用于流式细胞术 (FACS) 的 BAL 流体组分收集和免疫染色

4:27 结果:代表性 BAL 免疫细胞检测

6:17 结论

概括

肺的健康状况通过肺细支气管中存在的免疫细胞的类型和数量来反映。我们描述了一种支气管肺泡灌洗技术,该技术允许从小鼠下呼吸道分离和研究非粘附细胞和可溶性因子。

步骤

此过程的总体目标是通过支气管肺泡灌洗收集肺腔的细胞和无细胞内容物,用于离体分析和评估动物正在进行的疾病状态。该方法可以通过量化肺中的先天细胞和体液反应来帮助回答呼吸免疫学领域关于感染和炎症诱导的免疫机制的关键问题。该技术的主要优点是简单、高效、重现性高,不需要特殊设备或工具。

在开始手术之前,通过将 23 号针插入 0.5 厘米的透明塑料聚乙烯 21 号管中创建导管,并将动物置于仰卧位。固定鼠标的四肢并用 70% 乙醇消毒颈部。然后用手术刀在气管附近做一个皮肤切口。

打开皮肤以暴露唾液腺,并使用镊子将腺体分开并露出胸骨舌骨肌。使用镊子切开气管周围的肌肉。当它可见时,使用镊子在气管组织下穿过棉线。

接下来,使用 26 号针小心地刺穿两个软骨环之间的气管中间,并将预制导管插入气管腔约 0.5 厘米。用缝合线稳定导管。然后,用一毫升无菌平衡盐溶液加载一毫升注射器,并辅以 100 微摩尔 EDTA。

将加载的注射器连接到导管上, 将平衡的盐和 EDTA 溶液轻轻注入肺中。注射完所有盐水后,轻轻吸出溶液,同时按摩胸部。在注入和重新获取固体流体时要轻柔,以最大限度地回收 BAL 流体并最小化剪切力,这一点非常重要。

如果固体液体流经鼻子,请沿导管重新固定缝合线。收集完所有抽吸物后,将液体转移到冰上的 15 毫升管中,再重复灌洗两次。一旦掌握,如果操作得当,这项技术可以在七分钟内完成。

在第三次支气管肺泡灌洗液收集后,将汇集的抽吸物离心并将上清液储存在负 80 摄氏度。将沉淀重新悬浮在 200 微升的 ACK 裂解缓冲液中。在室温下不超过两分钟后,用一毫升冷 PBS 稀释裂解缓冲液,并通过离心收集细胞。

将沉淀重新悬浮在适当体积的 PBS 中以用于分析样品的数量,并将细胞等分到 96 孔板的适当数量的孔中进行分析。通过另一次离心收集细胞并将沉淀重新悬浮在 50 微升的 FC Block 和 PBS 中。在室温下放置 10 分钟后,向每个孔中加入 50 微升合适的目标抗体混合物,并在 4 摄氏度避光下孵育细胞 30 分钟。

在孵化结束时, 离心板并丢弃上清液, 将颗粒重新悬浮到每口井 200 微升的 FAX 缓冲液中, 用于流式细胞分析。使用基于各种支气管肺泡灌洗细胞群表面抗原差异表达的门控策略,可以识别各种免疫细胞类型。细胞和单线态根据它们的前向和侧向散射特性进行门控。

活/死染料阴性细胞被门控,然后识别 Cd11c 高和 Cd11c 低细胞。在 Cd11c High 群体中,巨噬细胞和树突细胞可以分别根据它们的 MHC-II 和 SinglecF 表达来识别。在 Cd11c Low 群体中,T 细胞和 B 细胞可以根据它们各自的 CD3/CD19 和 MHC-II 表达进行识别。

在剩余的细胞中,嗜酸性粒细胞和中性粒细胞可以分别通过它们的 Cd11b 或 Ly-6G 标记表达来识别。还可以添加计数珠,通过比较珠与细胞事件的比率来确定不同细胞群的绝对细胞数,例如,在幼稚与 LPS 刺激的动物中。收获 BAL 液后,可以执行其他技术,如 ELISA 免疫印迹细胞因子珠阵列,以回答有关 BAL 液无细胞含量的其他问题。

该技术开发后,为免疫学领域的研究人员探索小鼠肺腔的细胞和无细胞含量铺平了道路。观看此视频后,您应该对如何高效且可重复地执行 BAL 有了很好的了解。

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