细胞衰老标志物及检测方法—科研工具箱

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1961年,美国生物学家 Leonard Hayflick在体外培养正常人成纤维细胞时,发现一个奇怪的现象——即使给予最适宜的生长条件,细胞依旧不能无限制地进行增殖;在分裂至一定代数时,细胞周期似乎进入了一种“不可逆”的停滞状态,细胞不再分裂并最终走向死亡。

基于此种现象,Hayflick首次提出了细胞衰老(cellular senescence)概念;这种细胞增殖能力的极限,则被命名为Hayflick极限(Hayflick limit)。


我们都知道,细胞是机体生命活动的基本单元,细胞衰老和个体衰老之间有着密切的关系。因此自细胞衰老概念问世以来,数不清的科学工作者投身于该领域,以期从细胞衰老层面获取破解个体衰老奥秘的钥匙。

然而由于实验条件等因素的不同,研究人员对于细胞衰老的定义甚至都存在着差异。

为推进细胞衰老领域快速发展,2019年,来自多个国家的细胞研究人员所成立的“国际细胞衰老学会”(International Cell Senescence Association, ICSA)就细胞衰老的特征与生物标志物达成共识,并在国际著名期刊《Cell》上发表题为“Cellular Senescence: Defining a Path Forward”的文章。

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(原文链接:https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.005)

该文章明确规范了细胞衰老的定义、特征以及推荐检测方法。这里小P与大家一起学习一下~

一、细胞衰老的定义及特征

细胞衰老是一种由压力信号刺激产生,存在于特定生理过程的细胞状态。可由各种不同的细胞应激出发,如DNA损伤、癌基因激活、氧化应激或外源性毒物暴露等。细胞衰老不等同于细胞死亡,衰老的细胞在一段时间内仍保持代谢活性,也会出现一些明显的变化,具有典型的细胞周期停滞、衰老相关分泌表型、大分子损伤及代谢紊乱四个特征。

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(图片源于参考文章)

1. 细胞周期停滞

细胞衰老最基本的特征之一,就是细胞发生不可逆转的细胞周期停滞,可能是由有害刺激或异常增殖引起的警报反应。该现象是在体外鉴定细胞衰老最基本也是最不可或缺的指标之一。

2. 衰老相关分泌表型

衰老细胞会分泌大量的因子(见下表),包括促炎细胞因子和趋化因子、生长调节剂、血管生成因子和基质金属蛋白酶,统称为衰老相关分泌表型(Senescent Associated Secretory Phenotype, SASP)。SASP是衰老细胞的另一个典型标志之一,它介导了许多衰老细胞的病理生理效应,促进细胞与周围环境的交流,最终影响衰老细胞的命运。

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(图片源于参考文章)

3. 大分子损伤

(1)DNA损伤。细胞衰老所体现出的第一个分子表征是端粒缩短,端粒长度随着细胞增殖逐渐缩短,导致端粒DNA环的结构稳定性丧失以致端粒结构破坏,激活DNA损伤应答,最终阻滞细胞周期。此外其他通过诱导不可修复的DNA损伤来也可以导致细胞衰老。

(2)蛋白质损伤。蛋白毒性是个体衰老和细胞衰老的标志,因此蛋白质损伤有助于识别衰老细胞。ROS是蛋白质损伤的一个重要来源,它能氧化蛋氨酸和半胱氨酸残基,改变蛋白质的折叠和功能。同时,被ROS羰基化的氨基酸残基可与氨基反应形成希夫碱促进蛋白聚集,随后与糖和脂类交联形成脂褐素。

(3)脂质损伤。脂质对于细胞膜的完整性、能量的产生和信号转导都是必不可少的。一些与衰老相关疾病会影响脂质代谢,导致脂质结构的改变。然而由于衰老相关脂质谱的高度变异性,脂质指标作为衰老生物标志物的应用十分受限。

4. 代谢紊乱

衰老细胞中的线粒体功能减弱ATP生成受阻,同时还会产生大量的ROS,造成蛋白质损伤和脂质损伤。

衰老细胞中的溶酶体数量和大小均有增加,逐渐增多累积的功能失调的溶酶体可能会试图使细胞通过产生更多的新溶酶体来平衡,以期完成细胞能量不足或废物降解增多需求,此外衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)会在溶酶体积累。

二、细胞衰老的生物标志物

1. 衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)。SA-β-gal在正常人体细胞主要表达在溶酶体,最适pH是4-4.5;而在衰老细胞中,SA-β-gal不仅大量积累,最适pH还偏移至6,因此人为给予β-gal作用底物X-gal和pH6的环境,衰老细胞可以在β-gal的作用下,将底物转变为深蓝色,使得发生衰老的细胞在普通光学显微镜下即可观察到。

2. 脂褐素。脂褐素可使用生物素苏丹黑B(Sudan Black B, SBB)模拟物(GL13)标记,可以通过光学显微镜或组织化学方法在溶酶体中观察到,是衰老细胞检测常用的一种指标。

3. 细胞周期相关因子p16、p21、p53、RB、Ki67。RB和p53蛋白对于衰老细胞周期停滞至关重要。CDK2的抑制因子p21和CDK4/6的抑制因子p16会在衰老细胞中发生积累,这种积累促使RB家族蛋白持续活化,抑制E2F的反式激活,从而导致无法逆转的细胞周期停滞。Ki67是一种胞核蛋白,也是一种频繁使用的细胞增殖标志物。

4. 衰老相关分泌表型(SASP)。衰老细胞分泌的相关因子如IL-6、IL-8、IL-1、VEGF和MMP等也可作为细胞衰老的生物标志物。

5. 核纤层蛋白B1(Lamin B1)。核纤层主要成分层核纤层蛋白B1的下调是细胞衰老的另一个重要特征。核纤层蛋白B1的丢失与表观遗传学特征以及与衰老相关的染色质结构有关。

三、细胞衰老的检测方法

在体内,由于衰老细胞存在于各种组织中。不同组织的状态、细胞衰老类型都有所区别,所以目前还没有针对衰老细胞的绝对特异性的单一标志物

标记的特异性因细胞类型,组织,机体发育阶段,物种和其他因素而异。但是,一些标记具有更普遍的有效性,而另一些则与特定的衰老类型有关。因此,该文章中建议使用以下的多标记方法,确保能更准确地在原位检测衰老细胞:

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(图片源于参考文章)

1. 检测衰老相关的β半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)或脂褐质的积累量;

2. 与在衰老细胞中常见的标志物(p16、p21)及缺失的标志物(增殖标志物,Lamin B1)共染色;

3. 确定在特定的衰老环境中可能改变的因素(SASP、DDR、PI3K、FOXO、mTOR等)。

根据以上三个结果,结合细胞质、细胞核、SASP以及其他特异性标志物综合考量细胞衰老的发生,最精确的捕捉识别衰老细胞。

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