融合PCR操作步骤(利用融合PCR连接两个片段)—科研工具箱

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工具/原料dNTPs 、10×Buffer 、Taq 酶为Promega公司。
方法/步骤1:
1.引物设计:需要将A片段的3’端引物含有B片段的一部分,B片段的5’端引物含有A片段的一部分,这样分别扩增获得A和B就含有了互补片段。

如图中第一步中的P2含有一部分B片段序列,P3含有A片段一部分序列

图片[1]-融合PCR操作步骤(利用融合PCR连接两个片段)—科研工具箱-叨客学习资料网 方法/步骤2:

2.分别PCR扩增A和B片段,25μL体系一次扩增8管含有一管阴性对照,切胶回收这两个片段。

如上图第一步,单独扩增A和B片段

方法/步骤3:

3.以A和B两个片段为模板,进行融合PCR实验。融合PCR分为两步,操作步骤如下:

第一步:(不加引物)

dNTPs 1μl

10×Buffer 2.5μl

Template DNA (A和B) 各1μl

Taq 酶 0.5μl

RNaseA-free H2O 19μl

Total 25μl

循环参数:95℃预变性 5min,94℃变性 20s、57℃退火 20s、72℃延伸 40s 进行 10个循环,72℃延伸 5min。

如上图第二步:(第一步不需要添加引物,因为让A和B片段具有互补片段,可以互为引物扩增)

方法/步骤4:

4.第二步:10个循环后,取出反应管加入引物。
循环参数:95℃预变性 5min,94℃变性 20s、60℃退火 20s、72℃延伸 40s 进行 10个循环,72℃延伸 5min。待反应完毕后,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。
如上图第三步
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THE END
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