硬核汇总:RIP、RNA-pull-down和FISH实验原理与应用!—科研工具箱

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一、RIP(RNA immunopreciptation)

1.原理

①RIP技术(RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

 

②利用抗体特异性结合目的蛋白的特征,将细胞内蛋白质-RNA 复合物沉淀下来,对蛋白-RNA复合物中的RNA 进行检测的方法。

 

③RNA-免疫共沉淀

利用抗体专一性特征,检测蛋白质-RNA相互作用。

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2.RIP-qPCR 示例

①RIP-qPCR 研究细胞在有或无RA处理时 SIRT6蛋白上结合的lncRNA 。

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IgG或SIRT6抗体沉淀下复合物后,针对猜测的lncRNA设计引物检测是否有特定的lncRNA与SIRT6结合。

适用于验证与lncRNA结合的猜测的蛋白。

②RIP-microarray 研究6个细胞系内Ago2结合的miRNA 。

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Anti-Ago2抗体沉淀下复合物后,分离纯化RNA,再进行microarray检测结合到Aho2上的miRNA。

适用于研究某个特定蛋白但是预期结合的RNA未知的情况。

二、RNA-pull-down

1.RNA-pull-down原理

①RNA pull down, 即RNA拉下实验,是一种检测RNA与其结合蛋白(RNP) 之间的相互作用的技术。

 

其主要实验步骤为:

1、目标RNA生物素标记;

2、加入磁珠(通常用链亲和素酶标记)来富集RNA;

3、RNA结合蛋白孵育;

4、RNA结合蛋白洗脱;

5、进行WB检测或者MS检测(质谱检测)。

②在细胞外利用RNA-蛋白质相互作用拉下蛋白质。

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2.RNA-pull-down 示例

①RNA-pull-down-WB 研究细胞内pre-miR-let-7a-1结合的蛋白质。

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生物素结合的pre-miR-let7a-1将细胞内可与之结合的蛋白质拉下来,针对猜测的蛋白质进行WB验证。

适用于研究某个特定RNA与预期的某几个蛋白结合的情况。

②RNA-pull-down-质谱研究细胞内lncRNA TERRA结合的蛋白质。

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生物素标记的TERRA将细胞内可与之结合的蛋白质拉下来,蛋白纯化后进行质谱,得到可结合TERRA的所有蛋白的信息。

适用于研究某个特定RNA但是其结合蛋白质未知的情况。

三、Fluorescence In Situ Hybridization荧光原位杂交

1.FISH荧光原位杂交原理

①使用荧光标记的探针进入细胞,在互补配对、退火形成双链的基础上,将可与该探针结合的核酸(DNA.RNA)标记上荧光并显示位置。

②利用核酸互补配对特征,检测DNA、RNA位置或相对表达量。

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2.FISH荧光原位杂交示例

①DNA-FISH示例

针对DNA序列设计的荧光探针特异性标记基因。

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适用于研究某个特定基因在细胞内的特征。

②lncRNA-FISH 示例

针对lncRNA BCAR4设计荧光探针,检测BCAR4定位。

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③miRNA-FISH 示例

针对miR-15a和miR-155设计荧光探针,检测miRNA定位和相对表达强度。

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