免疫组化原理及实验步骤—科研工具箱

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  一、原理
  抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究。
  众所周知,抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性,即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物,制备特异性抗体,再用这种抗体(第一抗体)作为抗原去免疫动物制备第二抗体,并用某种酶(常用辣根过氧化物酶)或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,形成抗原 – 一抗 – 二抗复合物,将抗原放大,由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此,还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来(常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒,如图1)。通过抗原抗体反应及呈色反应,显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
  二、标本
  1、组织标本:石蜡切片(病理切片和组织芯片)、冰冻切片
  2、细胞标本:组织印片、细胞爬片、细胞涂片
  三、操作步骤
  ①石蜡切片制作
  1、固定:取组织,用PBS冲洗,放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h
  2、脱水:倒去固定液,用蒸馏水冲洗3次,再用50%酒精冲洗2次,用酒精逐级脱水,70%酒精1天,80%酒精过夜,95%酒精3h,无水酒精(Ⅰ)、(Ⅱ)各2h
  3、透明:1:1无水酒精二甲苯45min,二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)各30min
  4、包埋:(恒温箱内进行)浸入石蜡,1:1二甲苯石蜡(58℃)45min,石蜡(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)共2.5h,用石蜡(Ⅲ)包埋组织
  5、切片:包埋后的组织块经修整后,用切片机切成5-7μm,的石蜡带
  6、贴片:将组织石蜡块在50℃温水中展片,然后用处理干净的载玻片捞片,组织带可黏在载玻片上
  (洗片:1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶:防脱剂多聚赖氨酸)
  7、烤片:68℃恒温箱内烤片2h
  四、SP三步法
  1、 脱蜡:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60min,或60℃恒温箱中烘烤20min,后用二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)浸泡,共25min
  2、 水化:无水酒精(Ⅰ)、(Ⅱ)各2min,下行至95%、80%、70%酒精(Ⅰ)(Ⅱ)各2min
  3、 PBS冲洗2-3次,每次5min
  4、 阻断:3%H2O2去离子水(或80%甲醇)孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性
  5、 PBS冲洗2-3次,每次5min
  6、抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷却20min以上,再用冷水冲洗缸子,加快冷却至室温
  7、PBS冲洗2-3次,每次5min
  8、封闭:滴加正常山羊血清封闭液,室温孵育20min,甩去多余液体
  9、滴加Ⅰ抗50μl,室温静置1h,或者37℃1h,或者4℃过夜(需在37℃复温45min)
  10、PBS冲洗2-3次,每次5min
  11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40~50μl,室温静置1h,或37℃1h
  12、PBS冲洗2-3次,每次5min
  13、滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶),室温或37℃孵育30min-1h
  14、PBS冲洗2-3次,每次5min
  15、显色:DAB显色5-10min,在显微镜下掌握染色程度(胞浆呈棕色者判定为阳性细胞)
  (显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀,再加1滴显色剂C,摇匀)
  (A:DAB  B:H2O2  C:磷酸缓冲液)
  16、自来水冲洗10分钟终止反应
  17、复染:苏木精复染2min,盐酸酒精分化
  18、自来水冲洗10-15min
  19、常规脱水、透明、封片(用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上)、镜检;
  五、SABC法
  1)脱蜡、水化。
  2)PBS洗两次各5分钟。
  3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5~10分钟,蒸馏水洗3次。
  4)抗原修复。
  5)PBS洗5分钟。
  6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
  7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。
  8)PBS洗三次每次2分钟。
  9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分钟。
  10)PBC洗3次每次2分钟。
  11)滴加试剂SABC,20℃~37℃20分钟。
  12)PBS洗4次每次5分钟。
  13)DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。
  14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
  15)脱水、透明、封片、镜检。
  结果分析:每张切片选择5个高倍镜视野(400X),应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。。

附件:免疫组化应用技术指南IHC_application_guide

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