应用ImageJ对荧光图片进行半定量分析—科研工具箱

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1、安装后首先打开ImageJ:

2、打开要分析图片:File>open(热键为Ctrl+O)

https://yqfile.alicdn.com/img_6532077dc8d390dd6b78fe30386d1b17.jpg

3、转换成8bit的灰度图:Image>Type>8-bit

https://yqfile.alicdn.com/img_e160a024c92a3102fc32ef074c60ee24.jpg

4、黑白反转(因为对于光密度(OD)来说越白数值越小,纯白为0;越黑数值越大,纯黑理论上是无限大。因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转,不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小):Edit>Invert(热键为Ctrl+Shift+I)

https://yqfile.alicdn.com/img_74b48511638a0f824059644d3c6eceea.jpg

以下为从左到右分别为原图、8bit灰度图及反转后的图:

https://yqfile.alicdn.com/img_1d9478ed795977398d99f3faf436074e.jpg

5、校正光密度(软件默认为测量灰度,因此我们要改为更加适用的光密度,其中原理不是一两句话能说得清的,这里忽略):Analyze>Calibrate

https://yqfile.alicdn.com/img_afefd6f9b1691c58f9c07df62248a0e7.jpg

在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD,并下界面左下方勾选Global calibration,然后点击右下角的OK

https://yqfile.alicdn.com/img_f4c67ea7462bbd7fcaf7d78e4b958da4.jpg

点击OK后会跳出校正后的光密度曲线:

https://yqfile.alicdn.com/img_84ae5057fdce0d3c37e6d18e992784b3.jpg

如不勾选Global calibration,光密度的校正只对这张图片有效,一般分析都要分析多张图片,所以需要勾选,勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片,不勾选Disable Global Calibration,勾选Disable these Messages

https://yqfile.alicdn.com/img_21a6405939cc1b6b4f0babd6909374f6.jpg

6、选择测量单位(一般选择象素,如有明确的比例,也可以选择相应单位):Analyze>Set scale

https://yqfile.alicdn.com/img_14bae84ddddc3b6e68a9446a06773952.jpg

点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale,并勾选下面的Global(同样的,如不选Global这个测量单位的选择只对这张图片有效),最后点击OK

https://yqfile.alicdn.com/img_2cce6490ad8ef192f5724067509b47e3.jpg

7、选择测量项目:Analyze>Set Measurements

https://yqfile.alicdn.com/img_da8c95ee9a6b225faf811217e5ad683d.jpg

在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density,并勾选下面的Limit to threshold(这个选项是指只测量我们选中的范围,如不勾选侧会测量整张图片数据),选择后点击OK

https://yqfile.alicdn.com/img_4de32aed31b303c9f96549ee502f90b2.jpg

8、选择测量域值:Image>Adjust>Threshold(热键为Ctrl+Shift+T)

https://yqfile.alicdn.com/img_81a22349e88169e5bdfb66609da72212.jpg

滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值,以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中,选好之后点击右下角的Set

https://yqfile.alicdn.com/img_455f425dac88779b8dc019bf831757a3.jpg

在弹出来的界面点击OK

https://yqfile.alicdn.com/img_e75fef8a08769dae067da03c40f76ea7.jpg

9、测量:Analyze>Measure(热键为Ctrl+M或直接按M)

https://yqfile.alicdn.com/img_7e1254db7c440d93c42b471ba01a8d80.jpg

10、记录数据并计算:

https://yqfile.alicdn.com/img_59fff95ee8b6a1b97b0ddf6d8c85983c.jpg

结果中的Area为选择范围的面积,如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积;IntDen就是所选范围的IOD(光密度的总和)。

结果界面中的数据可以复制到Excel等软件中进行计算。

用IntDen的数值除以Area的数值得出来的就是这张图片中细胞的平均光密度,以这张图片的数据为例,即:18854/179252=0.105181532(/pixel)

同法测量多张图的平均光密度值后就可以进行半定量比较。

以下附上分别应用Image-Pro Plus及ImageJ对五张图片进行分析的结果对比:

https://yqfile.alicdn.com/img_d142665fafdb58a2a99b97975df31a2d.jpg

从结果的对比看来ImageJ与IPP(Image-Pro Plus)的分析结果是基本一致的

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