一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱

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  先着重介绍几个在线设计gRNA的工具:
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着重推荐Lei Stanley Qi Lab http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp  
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这个在线站点功能比较丰富,可以选择基因编辑工具的其他用途(激活,抑制基因表达等)(图1-1)。

图片[1]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网

图1-1 选择编辑类型

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下一步就是选择物种(图1-2)。但只有常见的9种。

图片[2]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网

图1-2 选择物种

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再下一步就是直接输入基因的名称(或序列)即可(图1-3)。

图片[3]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网

图1-3 选择基因名称。

总结

但是出来的sgRNA位置有一些并不总在ATG的下游(图2所示,1,2,6,9,12,16,22几条sgRNA位于ATG的上游)。所以根据位置,对于做基因的敲除(KO)而言,强烈建议选择ATG下游通常100 aa以内范围内的sgRNA来用(比如图3中的3,5,7,10等较下游的);而且,一定要位于CCDS区域内(CCDS是consensus   CDS,即公共的CDS区域,是针对很多个转录本[isoforms]定义,图2中路色条框即是。这个很重要!!!)。

图片[4]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网

图2

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Feng Zhang lab:http://crispr.mit.edu/这是最早的一个设计站点。包括常见的16个物种。选中物种,把你要设计的区段序列pia到下面的框里运行就行。但前提是你自己已经选好了位置(图3)。

图片[5]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网
图3

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还有其他,如omictools下面的Cas-Designer  http://www.rgenome.net/cas-designer/这个站点内容更加丰富,比如物种覆盖式最多的,包括植物,昆虫等等(图4左)。这个站点也是输入目的基因的序列定制的,不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。

图片[6]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网
图4

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还有一些商业公司的,比如Thermo下面的(图5):https://apps.thermofisher.com/crispr/index.html#/search物种较少,商业性目的特别强,了解下即可。

图片[7]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网图5

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其实你只要google一下会发现特别多的设计工具,感兴趣的可以自行探索。

图片[8]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网
图6

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 手动版设计方法—好用不贵

手动版本虽然费事,但有时候却会事半功倍,节约后续鉴定单克隆的成本。我们举例来说:

图片[9]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网
图7

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序列中PAMsgRNA的序列放大如下(前提是sgRNA位于CCDS区域,而且特异性要保证):

图片[10]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网

图8

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Cas9切割位置(确定的)跨过一个酶切位点(比如sfcI)(在上篇文章中都有所提及)。这样,Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候,酶切位点一定会遭到破坏。这为后续的单克隆鉴定提供了便利。请看示意图(图9):

图片[11]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网
图9

 注意:PCR引物设计的时候确保PCR片段内部不要出现第二个SfcI的酶切位点。这样后面酶切的时候结果是唯一的。实验流程和鉴定结果应该是这样的(图10):

图片[12]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网

图10

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对于WT,酶切是充分的,不会残留。而对于成功编辑的两个mixture:*1和*2,由于产生了indels,部分sfcI的位点造到破坏,sfcI切不动的。对于成功编辑的单克隆而言,应该是一点都切不动。后续鉴定只要这样的克隆去测序即可(图11,红色编号为阳性克隆)。

图片[13]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网

图11

TA克隆结果(图12):

图片[14]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网

图12

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 其他Cas9,比如Cpf1和saCas9的设计

因为以上介绍的站点没有涉及Cpf1和saCas9,特别是saCas9(非常适合AAV介导的载体基因编辑)。http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html 这个网站兼容几乎所有类型的Cas9设计。

打开页面,输入要编辑区域的基因组序列,然后在PAM类型里选择你需要的Cas9类型,比如spCas9,saCas9以及cpf1等。其他条件默认设置即可,然后点击sunmit即可。非常傻瓜式的操作(图13,14)

图片[15]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网
图13

图片[16]-一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析—科研工具箱-叨客学习资料网
图14

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