寻找KO的阳性克隆——Cruiser™酶—科研工具箱

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近年来,ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因组编辑技术可谓是层出不穷,尤其是CRISPR/Cas9,一出现便在全球范围内掀起一股热潮。同时,各大公司也开发出一系列相应的产品,其中一种至关重要的就是基因敲除阳性克隆筛选的试剂。

目前,市面上只有Genloci的Cruiser™、Transgenomic的SURVEYOR和NEB的T7EI这三种产品和测序这种方法,被用于基因敲除阳性克隆的筛选。然而,SURVEYOR是进口产品,价格贵,货期长;T7EI可以识别多种DNA结构,如十字形DNA结构、Holliday结构等,故易出现假阳性;测序耗时长(1-3天),常常出现测序无信号等问题。

今年年初,Genloci通过植物基因工程表达产生高纯度的Cruiser™酶,它是一种具天然强活性的酸内切酶,与CelⅠ同源。该酶能够高效特异地识别异源双链DNA的突变位点,并从突变位点的3’-端高效地切割异源双链DNA,不会出现假阳性。

今年6月,Genloci推出Cruiser™基因敲除检测试剂盒,该试剂盒可广泛应用于精确检测人、哺乳动物、细菌、真菌、病毒以及植物基因的敲除,尤其适用于ZFN技术、TALEN技术和CRISPR/Cas9技术的基因敲除研究。

实验流程

1. 基因组DNA的准备:提取野生型和突变型细胞的基因组DNA。Genloci公司专为阳性克隆筛选设计的TNA抽提试剂盒也能帮您的忙,只需500个左右的细胞即可提取全基因组DNA。

2. 杂交DNA的准备:

a) PCR引物设计:一般扩增产物长度为300~600 bp

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b) PCR扩增:获得杂交DNA

3. Cruiser™酶筛选阳性克隆:无需纯化DNA,直接使用PCR产物,混合体系后45℃下反应15~20 min
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K562细胞中Atg10基因敲除案例

M:100 bp-DNA Marker;pool:混合克隆;clone1-18:单克隆;positive:Positive Control DNA

结论:pool(混合克隆)的结果显示,基因敲除的效率约为40%。clone3, 7, 8, 11, 15和17为潜在的阳性克隆,后续直接进行TA克隆进行验证等位基因突变情况。

现在,您是否还在为筛选不到阳性克隆而烦恼,有了这一款产品,相信就可以高效精准地找到KO阳性克隆了。

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