核质分离检测LncRNA/circRNA的亚细胞定位—科研工具箱

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众所周知,研究非编码RNA必定要对LncRNA/circRNA进行亚细胞定位,研究非编码RNA亚细胞定位的方法有:荧光标记探针进行原位免疫荧光(FISH)、分离胞浆和胞质的RNA进行PCR检测。当然经费充足的话FISH是首选,即可定性也可定量,还有细胞照片,可信度最高。但是实验室没这条件,外包不放心还死贵。所以我选择后者。

目前已知的分离胞浆和胞质的RNA的标准方案有:Ambion® PARIS™ Kit (Catalog number: AM1921)和Norgen Biotek公司Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification Kit (NGB-21000)。以上两种试剂盒都是有大量文献使用的,但是价格较贵(约4500块/50T)。廉价替代方案还是有的:碧云天P0028+RNase Inhibitor (参考帖子https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/31149116

碧云天P0028是用来抽提胞浆和胞核蛋白质的,但是咨询技术后我得知试剂盒中不含有破坏RNA的组分,目前确立了如下Protocol:

  • 所需仪器、用品与试剂:

细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Beyotime P0028)、RNase Inhibitor(Beyotime R0102)、Trizol试剂、无酶EP管、移液枪、无酶枪头等

  • 操作步骤:

1. 准备溶液:使用前从-20℃冰箱取出P0028试剂盒,室温融解试剂盒中的细胞浆蛋白抽提试剂A和细胞浆蛋白抽提试剂B,溶解后立即放置在冰上,混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用,在使用前数分钟内加入RNase-free Water稀释的RNase Inhibitor,使其最终浓度为1-2U/µl。(所有试剂置于冰上备用)

2. 对于贴壁细胞:用PBS清洗一遍,胰酶消化细胞,并计数。低速离心收集细胞,弃培养基,PBS洗一遍,低速离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。(置于冰上)

3. 对于悬浮细胞:细胞计数后用PBS洗一遍,离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。(置于冰上)

4. (冰上操作)每20μL细胞沉淀加入200μL添加了RNase Inhibitor(含未稀释的R0102 10μL)的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万HeLa细胞,其细胞沉淀的体积大约为20μL或40mg。)

5. Vortex 5秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长vortex时间。)

6. 冰浴10~15min。

7. 加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10μL。Vortex 5秒,冰浴1分钟。

8. Vortex 5秒,4ºC 12000g离心5分钟。

9. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中,加入Trizol抽提细胞浆RNA。(千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。)

10. 对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入Trizol抽提细胞核RNA。

11.以下步骤同Trizol法提取总RNA。

RNA抽提质量评估:

1.RNA浓度:A260 x dilution factor x 40= μg RNA/mL;

(1 A260= 40 μg RNA/mL)

注意DNA污染,否则A260吸光值增加。

2.RNA产量:标本不同,产量相对也不同。但基本产量范围是固定的。

105的细胞=1 μg,1mg组织=1~10 μg

3.RNA纯度: A260:A280=1.8-2.1

4.1%琼脂糖凝胶电泳UV成像观察条带:胞浆可见明显28S/18S 双条带,亮度略低于总RNA,而胞核双条带亮度很低。

下图为标准方案中的PARIS试剂盒提取质检图(变性琼脂糖凝胶电泳)

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Temp\1621320905(1).png

T  total    C  cytoplasmic   N   nuclear

国产替代方案RNA提取后质检参考图片:

等做完实验加上图

强烈建议抽提之后进行电泳评估抽提质量后再进行PCR操作。

核质分离实验注意事项:

1、核质一定要分离干净,吸取胞浆上清的时候一定不要吸到沉淀,同样地,对于沉淀,要完全吸尽残余的上清(吸到沉淀无影响)。

2、无论什么方法分离必定有损耗,所以不用纠结。

3、RT-PCR加样时务必保证加入了等量的胞浆RNA和胞核RNA,这样才能使用简化公式。

4、使用最优引物保证在较大浓度范围内扩增效率接近100%,否则不能使用简化公式。

结果分析方法(简化公式):

核%=2^-胞核CT值/(2^-胞浆CT值+2^-胞核CT值)

质%=1-核%

公式原理:本人称之为假定内参法

假设有基因Z,基因Z在胞浆和胞核中各占比50%,同时取1000ng胞浆RNA和胞核RNA进行逆转录得到cDNA,在用此cDNA进行PCR(不稀释或者稀释同等倍数),那么PCR得到胞浆RNA和胞核RNA的基因Z的CT值必定一样(显而易见么,加样时基因Z的模板量一样,其他条件相同),我假设CT值都是15,而GAPDH的CT值,胞浆14,胞核16,那么以胞核GAPDH的相对表达量为1,胞浆GAPDH的相对表达量用2^-ΔΔCT 计算就是4,最终得到GAPDH的质%为80%,核%为20%。

同样的,以目标基因Y在胞核的相对表达量为1,目标基因Y在胞浆的相对表达量计算结果就是

图片[2]-核质分离检测LncRNA/circRNA的亚细胞定位—科研工具箱-叨客学习资料网

实际操作:

1、导出PCR结果CT值到Excel

2、按简化公式计算对应比例

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Temp\1621325106(1).png

3、结果导入GraphPad画图

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Temp\1621325125(1).png

新建数据,选择Grouped,3个重复

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Temp\1621325147(1).png

把Excel计算好的结果数值复制过来

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Temp\1621325218(1).png

选择二维分组柱状图

本文参考:https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/31149116

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