线粒体蛋白、细胞核/质蛋白提取—科研工具箱

一、 线粒体蛋白提取

1. 线粒体蛋白抽取液配方(pH7.4)：
   250mM蔗糖，20mM HEPES，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，17ug/mL PMSF，8ug/mL aprotinin，2ug/mL leupeptin；-20℃保存。
2. 步骤：
   （1）收集5X10E7细胞，并用 PBS洗细胞；
   （2）往细胞沉淀加入2mL上述抽取液，并混匀，可以采用超声或匀浆器方法破膜，程度至苔盼兰染色约90%的细胞为蓝色。
   （3）750g，4℃离心5分钟，收集上清，此时沉淀即为细胞膜成分。
   （4）13000rpm,4℃离心30分钟, 弃上清，此时沉淀即为线粒体成分。
   （5）用100uL列解液重悬沉淀，-80℃保存备用.

二、 培养悬浮细胞全蛋白裂解的方法

1. 细胞裂解液（pH8.0）的配方：
   20mM Tris-Cl，1% NP-40, 137mM NaCl, 20mM DTT, 2mM Sodium Vanadate，1ug/mL Aprotinin, 1ug/mL leupetin, 1mM PMSF；配好后分装-20℃保存，其中 PMSF和蛋白酶抑制剂量使用时现加。
2. 裂解方法：
   （1） 按1X10⁶细胞/100uL的比例加细胞裂解液,混匀后冰浴30分钟；
   （2） 12,000rpm, 4℃,离心10min；
   （3） 实验时取25uL的上清加5uL 6X上样缓冲液煮沸5分钟使蛋白变性后，12000rpm离心5分钟，取上清和预染Marker加样电泳。或-80℃保存备用。

三、 细胞核蛋白质的提取

1. 试剂准备

• 操作步骤
  （1） 去细胞培养液，用PBS（含0.05mmol/LPMSF）洗两次，用刮板将细胞刮下，计数细胞，收集于适当体积离心管，用少量PBS冲洗平皿一并吸入离心管。
  （2） 4C离心5分钟，使细胞沉淀。
  （3） 弃上清，将沉淀的细胞用含PMSF的PBS悬起再离心，重复两次。洗去全部细胞培养液及血清成分。
  （4） 取5×10^5-7细胞，4C离心，弃上清。
  （5） 加入400μl冷缓冲液A，手指弹管壁使沉淀悬起，冰浴10分钟，震荡10秒钟，混匀。
  （6） 离心10秒钟，弃上清，加20~100μl冷缓冲液B使沉淀悬起，冰浴20分钟。
  （7） 4C离心2分钟，弃沉淀。
  （8） 上清为核提取物，分装后-70C保存。（此法每1×10⁶细胞可得到50~75μg核蛋白质）。