利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱

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之前已经介绍过Snapgene的安装与使用,我们在进行分子生物学设计的时候经常用到这个工具:

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Microsoft\Windows\INetCache\Content.Word\2.png

这样:

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Microsoft\Windows\INetCache\Content.Word\1.png

还有这样:

图片[3]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网

下面介绍一下如何利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案:

序列获取

软件给出的结果一般都是以下形式,给出的只有突变所在基因组位置或者区间信息。

图片[4]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网
indel检测示例1
图片[5]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网
snv检测示例1

那么该怎么去设计PCR验证实验的引物呢?

首先,我们这里对snv取鉴定到的位点的上下游各400bp,indel的话是区间位置的上下游200-300bp。
拿上图的snv举例,它的Start和End分别是48556379和48556379,那么各加400bp,则位置变为:48555979和48556779。同时要注意这里注释出来时ABBCA13这个基因。
那么接下来就先在NCBI的Nucleotide数据库检索这个基因:

图片[6]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网
ncbi

然后选择第一个检索出来的GENE的链接:

图片[7]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网
检索示例

再把页面下拉到“Genomic Regions, transcripts, and products”这边,点击右边的“FASTA”

图片[8]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网
检索示例

这时候可以看到右边有一个”Selected region”

图片[9]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网
特定基因组位置序列获取示例

最后再把刚才取好的上下游400bp扩展后的基因组位置输入到这个区间,就得到这段的序列了,然后根据序列使用Primer premiere设计验证引物即可。

图片[10]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网
特定基因组区段的序列获取

扩增出序列之后进行Sanger测序,验证SNP或Indel位点。

RFLP检测

RFLP是指DNA片段的限制性酶切片段多态性,SNP的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,缩写RFLP)检测流程如下:

1.        选择合适的限制性内切酶,该酶能够特异性识别SNP位点的碱基种类,当SNP位点碱基变化时,能够使该酶失去原有的识别位点;

2.        设计扩增引物,将包含SNP位点的一段DNA扩增下来,且保证其中只有一个该酶的识别位点;

3.        使用限制性内切酶对产物进行酶切、电泳,通过产物带型来确定SNP的碱基种类。

因此,该方案的核心有两个:限制性内切酶的选择及扩增引物的设计。

一、 限制性内切酶的选择

由于SNP位点出现的随机性,很难一眼就看出该序列位于什么酶的识别位点,而使用SnapGene软件,就非常容易了。

举个例子,检测RS2267668 [A/G]多态性:

【1】将SNP位点分别设置为A和G,得到两条序列,将序列都放入SnapGene,开启左上角酶切位点按钮,建议最初选择所有的(All Commercial)

图片[11]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网

【2】 对比两者,发现当SNP位点碱基为G时,多出一个酶切位点:Hpy188I。这就意味着,可以使用该酶进行该SNP位点基因型的检测。

限制性内切酶选择结束,简单而高效~

二、 设计扩增引物

从序列的酶切位点分布看,这个酶有四个识别位点:

图片[12]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网

本着RFLP的引物设计原则,应该保证扩增产物中只有一个识别位点,因此可以在上述蓝色方框范围内使用Primer premiere进行引物设计,使产物长度为200~1000bp,且酶切位点左右序列长度差异>100 bp以保证电泳带型明显。

图片[13]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网

引物设计好之后,将F/R引物的扩增产物新建一个SnapGene文件,准备进行PCR电泳预测:

点击“Tool”标签栏中的“模拟DNA电泳”,弹出新的页面,其中:

点击电泳图中的MW,选择需要用到的Marker:

图片[14]-利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案—科研工具箱-叨客学习资料网

点击泳道1,选择使用F和R引物扩增该条带:

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Microsoft\Windows\INetCache\Content.Word\10.jpg

点击泳道2,选择使用Hpy188I酶切扩增条带:

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Microsoft\Windows\INetCache\Content.Word\11.png

最后调整一下胶浓度和电泳时间,就得到了完美的模拟电泳条带图,以他为目标,放手去做吧!

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Microsoft\Windows\INetCache\Content.Word\12.jpg
RFLP检测
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