流式染色常见问题解答—科研工具箱

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1.问:流式染色离心力如何选择?

答:若只是表面染色,细胞离心力推荐300 g~500 g,若细胞比较大(肿瘤细胞)300 g离心,细胞比较小(淋巴细胞)500 g离心,离心时间5~10 min。若是胞内染色,因涉及固定破膜过程,细胞会脱水变轻,因此需提高离心力,推荐离心力600~800 g,根据不同品牌的破膜剂及破膜时间来选择具体离心力,离心时间建议10~15 min。

2.问:流式染色时间及温度如何选择?

答:流式染色是抗原抗体的结合反应,此过程结合非常快,而且非常牢固,但染色过程要尽量让所有抗原都能结合抗体分子,所以加入抗体一定要混匀,我们一般选择室温染色15 min或者4℃染色30 min,染色中途混匀一次,建议轻弹管子(枪头吹打可能会对细胞受损,死细胞增多,导致非特异性结合增加)。

3.问:流式染色需要购买FcγR Blocking吗?

答:若染了同型对照,FcγR Blocking这一步骤可以省略,若没有染同型对照,只要是知道抗原清楚表达,细胞分群很明显的也不用FcγR Blocking,总之言之,绝大多情况下都不需要这一步骤。当然磁珠分选都要有这一过程,因为磁珠分群没有办法去除背景,Fc受体的结合对结果会影响很大(特别是分选免疫细胞)。

4.问:流式上样速度如何选择?

答:一般建议上样速度控制在10000个/秒以内,上样速度太高,容易堵塞吸样针,并且会导致检测不准确。

5.问:细胞体外放置多久仍可染色?

答:若细胞来不及处理,只有表面染色,细胞可放在4℃  6~12 h,对染色结果影响不大;若是胞内因子的染色需要及时处理,因细胞有刺激过程,需要细胞保证活性。对于凋亡染色、线粒体膜电位分析及检测胞内酶活性必须要及时染色。

6.问:流式染色需要购买Staining Buffer吗?

答:没必要,Staining Buffer的配方就是PBS加入1%BSA或FBS。可实验室自行配置。配置后最好过滤去除一些未溶解的颗粒,因颗粒杂质容易堵塞流式吸样管。

7.问:细胞固定后能染色吗?

答:建议固定后不要染色,因甲醛固定后会导致某些抗原表位的丢失(甲醛固定时细胞氨基基团会发生交联,从而掩盖抗原的表位),另外,残留的甲醛会和抗体分子非特异性结合,这些都会导致染色效率不高;若因不可抗拒原因需要固定后染色,一定要清楚固定后抗原是否受影响(可实验验证),建议PBS洗涤细胞两次后染色。

8.问:细胞染色后是否可以固定?

答:有时因实验安排,需要隔天检测,这时候需要固定细胞,一般我们用4%多聚甲醛(有成品的液体,也可买粉末自行配置)或者用荧光抗体保存液固定细胞,但如果染色的抗体颜色是耦联染料(PE-Cy5、PE-Cy7、PerCp-Cy5.5)不能固定,因为耦联染料在固定时会解偶联,这会导致荧光染料降解。荧光抗体保存液的配方是( 2 g葡萄糖,1ml甲醛加到100 ml PBS里溶解后再加0.5ml  20%叠氮钠)。

9.问:细胞染色的阴性对照管如何设定?

答:若有同型对照,应以同型对照为阴性对照管,画门时,阴性对照管的比例应界定在0%~3%之间,这是默认的不表达。在没有设置同型对照时(可参照前文中同型对照章节的介绍),可用裸细胞来设置阴性对照管。

10.问:细胞自发荧光如何解决?

答:培养时间较久的原代细胞、药物处理(药物本身就有自发荧光)的细胞、植物细胞(含有叶绿素)、分泌核黄素的细胞、这些细胞自发荧光比较强,在流式染色中不能忽视,一般自发荧光在第一检测通道(FITC)和第二检测通道(PE)上干扰比较多,当然其他检测通道也有(特别是药物干扰),存在自发荧光的情况下,一定要注意对染色结果的影响(特别是做低表达抗原检测时),如果允许,尽量选择避开干扰的荧光染料。在做凋亡检测时,经常会遇到自发荧光干扰的问题,一定要注意选择避开干扰的Annexin V染料,如Annexin V-APC。

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