从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网

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PCR只要把引物设计的好，实验简直易如反掌，有同学留言要oligo6.0安装包，但是进哥电脑装不了，为此分享一下零基础版的Oligo7引物设计教程。

Oligo7软件安装

为防止大家和我以前一样在网上下载软件中毒，我提供一个无毒下载破解版链接：

链接：https://pan.baidu.com/s/1fqfQC2YqqpJhdlHZbZK5Zw
提取码：ogvp

下载解压后，点击开始安装，安装完后，点击桌面的Oligo7图标，弹出注册“OLIGO 7 Customer Registration”界面，此时你需要点击安装包内就会弹出“Oligo 7.0 Keymaker”界面。

图片[3]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图一

如图一左，将“OLIGO 7 Customer Registration”界面上原有的Workstation 数字复制粘贴到“Oligo 7.0 Keymaker”内的Workstation，然后点击Generate得到Access数字,将得到的Access数字粘贴回“OLIGO 7 Customer Registration”相应位置，单击“Confirm Code”按钮即可完成注册破解。

找到目的基因序列

找到目的基因序列才能针对设计引物，如果有同源蛋白还需要查找目的基因CDS序列取交集。以我研究的大鼠AQP1为例，先打开NCBI，选择Gene数据库，输入名字+物种，点击“Search”，弹出图二左，点击下方“AQO1”进入新界面，下拉点击右侧”RefSeq RNAs”，如图二右。

图片[4]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图二

新界面下拉，出现图三左，点击“CDS”出现图三右，复制途中棕色区域序列，即为我们目的基因的CDS序列。当然，如果没有同源蛋白的问题，你可以直接复制所有序列进行分析。

图片[5]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图三

设计引物序列

打开Origin7，点击“File”下拉菜单里的“New Sequence”,将序列粘贴在窗口里如图四，点击“√”就可以进入分析界面。

图片[6]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图四

新界面里点击“Search”,点击“for Primers & Probes”如图五左上，然后界面弹出图五右上，点击“Parameters”和“Ranges”，根据反应条件设置参数，一定要修改引物长度，防止引物过短，我习惯修改为图四下，然后点击“Search”就可以自动得到结果。

图片[7]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图五

Oligo7自动给出了可能的引物对，只需要点击右侧框内“Score”，引物按软件认为的优劣进行排序，你可以看到引物的关键信息，比如长度，Ta值，GC含量。我这里参数设置少所以图六内结果多，一般限定多个参数后，软件只给出几对引物。

图片[8]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图六

分析引物并选择

选择一条引物，点击上方“Analyze”，然后点击“Key info”内的“Selected Primers”，会弹出两条引物的序列和其他概括信息如图七。这里需要确保|3`△G|≤9kcal/mol，以防止在错配位点形成双链结构引起DNA聚合反应。

图片[9]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网

图七

满足图七后，要继续进行6项分析以确保自己的引物是最合适的，这6项我在图八中已经标识，我接下来将结合自身经验逐一细讲。

图片[10]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图八

①二聚体形成分析：为了防止引物之间相互形成二聚体，我们需要点击“Duplex Formation”分析“Forward Primer”,“Reverse Primer”，确保△G≤4.5kcal/mol，hydrogen bonds≤3，如图九右。求稳的话还要分析“Upper Oligo”和“Lower Oligo”,那样可以阻止上下游引物之间形成二聚体。

图片[11]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图九

②发卡结构分析：为了阻止发卡结构形成，需要选择菜单内“Hairpin Formation”，分析“Forward Primer”,“Reverse Primer”，同①一样要确保△G≤4.5kcal/mol，hydrogen bonds≤3。

③碱基组成与Tm值：点击图八中的3的“Composition&Tim”分析，按规矩需要控制上下游引物GC含量在40%-60%，上下游引物GC含量也不可以差太大，但其实实际中，引物GC含量70%我也扩成功过，上下游引物GC含量差10%也可以做，所以请根据自己实际情况抉择，在Oli’go7里分析的结果给出的参数很多，你只要看我图十左里红圈的两个参数即可。

图片[12]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图十

④错误引发位点：点击“False Priming Sites”即可以分析。个人感觉实践中意义不大，因为往往正确概率很高如图十右，错误概率即使达到130问题也不大，所以大家这里自己抉择吧。

⑤PCR总览：如果你的引物有太明显的问题，在这个界面的“Comments”下方白框里会出现如图十一右的红字提示，那么你就需要根据提示修改或者更换引物。如果没有，则会和图十一左“Comments”内为空白，你只需要根据这里提供的Tm值，然后减5，就是你设计的这条引物的退火温度。

图片[13]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图十一

⑥内稳定性：上述分析完后，点“Internal stability”这个选项，最好弹出来的曲线图像如图十二：中间高两边低的弧形，这样的引物稳定性高，成功概率更高，其实实践中如果做不到问题也不是很大。

图片[14]-从0开始，准确又快速利用Oligo7设计PCR引物—科研工具箱-叨客学习资料网 — 图十二

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