泛素化专刊:通路调控、病理过程、药物研发和实验手段—科研工具箱

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泛素化对信号通路的调控

很多信号通路,如AKT-mTOR通路、Hippo-YAP通路和NF-κB通路,都会采用泛素化降解的方式关闭信号传导,因此泛素化过程对于信号通路的调控非常重要。

 

1)在AKT-mTOR通路中,两个E3泛素蛋白连接酶TRAF6和SKP2,可促使AKT的第8和14位的赖氨酸发生K63型的泛素化,进而促使AKT定位于细胞膜上,只有如此AKT才会被相应的激酶激活,从而在细胞内传导信号。

 

而去泛素化酶CYLD则能特异性地去除AKT的泛素化标记。此外,CHIP、Nedd4、TTC3也能够通过K48型的泛素化降解途径降解AKT来关闭AKT-mTOR信号通路。

 

2)在Hippo-YAP通路中,当细胞配体Dchs1/2和受体Fat4结合后,可依次激活激酶MST1/2和激酶LATS1/2,磷酸化转录调控因子TAZ和YAP 后与14-3-3蛋白结合,可阻止TAZ/YAP与转录因子TEAD相互作用,负调控下游基因转录以限制组织的过度生长(图1)。

 

图片[1]-泛素化专刊:通路调控、病理过程、药物研发和实验手段—科研工具箱-叨客学习资料网

图1:Hippo信号通路示意图

 

其中,E3酶CRL4DCAF1和SIAH2能分别促进LATS1和LATS2的泛素化降解过程,从而抑制Hippo信号通路。而SIAH2还起到连接HIF1α信号通路和Hippo信号通路的作用。

 

3)在NF-κB通路中,抑制因子IκB结合并抑制胞浆内的NF-κB的功能。当IKK激活后,IκB被磷酸化且在E3酶β-TRCP的作用下发生K48型的泛素化修饰;在IκB被降解后,可使NF-κB进入核内以激活下游基因的表达。

 

另外,E3酶TRAF6泛素化激活TAK1复合物,进而可顺次激活IKK以及NF-κB通路;而去泛素化酶A20可和RNF11、ITCH和TAX1BP1形成复合物,以去除TRAF6形成的K63型的泛素链,避免NF-κB信号通路过度激活。

 

图片[2]-泛素化专刊:通路调控、病理过程、药物研发和实验手段—科研工具箱-叨客学习资料网

图2:NF-κB信号通路示意图

 

泛素化异常介导的病理过程

 

1、泛素化异常与恶性肿瘤

 

目前泛素化异常主要是通过三条途径引发恶性肿瘤的发生:

 

1)调控细胞周期蛋白的稳定性。泛素化异常可致使细胞周期相关蛋白表达紊乱和细胞周期失控,最终导致细胞癌变;

 

2)调控肿瘤抑制因子的表达。当泛素-蛋白酶体系过度激活时,p53蛋白会被过度泛素化降解,表达量过低,则无法起到抑癌基因的作用;

 

3)参与调控多条关键的信号通路。泛素化异常可导致信号通路发生异常,致使细胞癌变。

 

2、泛素化异常与神经退行性疾病

 

异常蛋白的积聚和沉积(如阿尔茨海默病的tau蛋白和β-淀粉样蛋白)是神经退行性疾病的共同病理机制,而已有研究证明泛素化异常可能是导致神经退行性疾病的主要原因。因而激活蛋白酶体、增强其对错误折叠蛋白质的降解能力,已经成为治疗神经退行性疾病的一种可能的方法。

 

基于泛素化的药物研发

 

因此,近年来泛素化过程已经逐渐成为了肿瘤的治疗靶点,因而泛素-蛋白酶体系统中的关键组分开发相应的抑制剂在临床上具有重要的意义。

 

1)针对泛素蛋白连接酶E3的药物

 

因泛素蛋白连接酶E3能够特异性识别待降解的底物,因此,目前针对E3酶的药物研发是整个泛素化过程中最为受到关注的领域。

 

在人类基因组的众多E3酶中,以MDM2、E6AP、SKP2、Nedd4和Fbw7为基础的研究最为常见。

 

MDM2能促进p53蛋白的泛素化降解,可阻断由p53介导的细胞周期阻滞或细胞凋亡。第一个以E3酶MDM2为靶点的小分子抑制剂Nutlin则首先被研发出来,但Nutlin对含有突变型p53的肿瘤细胞往往效果不佳。

 

SKP2可识别并泛素化降解很多的肿瘤抑制因子,如p21、p27、钙粘蛋白(cadherin)、FOXO1,诱导细胞发生癌变。

 

在以SKP2为靶点的抑制剂中,Cpd A可通过阻止SKP2进入SCF(Skp1-Cul1-F-box) E3酶复合物,并抑制SCF复合物的功能,能引发肿瘤细胞的G1/S期细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞发生凋亡。

 

另一种抑制剂SMIP0004则能下调SKP2的表达水平,从而诱导前列腺癌细胞G1期细胞周期阻滞,抑制细胞的增殖和集落的生成。

 

2)针对蛋白酶体的药物

 

用蛋白酶体抑制剂处理肿瘤细胞,可打破肿瘤细胞内部促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡,诱发肿瘤细胞的周期阻滞和细胞凋亡现象。因此,蛋白酶体抑制剂被认为是克服化疗增敏、遏制肿瘤细胞扩散的有效靶点。

 

目前,第一代蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib)和第二代蛋白酶体抑制剂卡非佐米(Carfilzomib)在治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤等方面已有不错的疗效。

 

泛素化研究的实验手段

 

1)生物信息学分析

 

目前关于蛋白的泛素化修饰,数据收录最为齐全的是Uniprot数据库(网址:https://www.uniprot.org/),它会根据发表的文献收录蛋白翻译后修饰相关的信息,以供网友们查询。

 

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点击“PTM/Processing”就可显示出所有文献中报道的和p53相关的翻译后修饰的类型和发生修饰的位点以及相应的文献。

 

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显然,对于p53而言,发生泛素化的位点有两处:291位和292位。如果想要深入了解相关信息,可以点击旁边的publication按钮即可。

 

然而Uniprot数据库并不是一个专门只收集蛋白泛素化信息的数据库,因此Uniprot数据库在泛素化信息收集的专业性方面还存在诸多的不足。除了Uniprot数据库之外,还有一些专门收集蛋白泛素化信息的数据库:UbiProt、E3Net和 hUbiquitome

 

UbiProt (http://ubiprot.org.ru/) 是一个收录泛素化修饰底物蛋白的数据库。其中每个数据条目都是通过人工手动的方式进行提取并注释的,描述了特定的泛素化底物蛋白信息,如蛋白的性质、物种来源、泛素化修饰特征、参考文献及相关链接等。其数据来源于一些大规模组学实验数据,而其余的底物蛋白数据是从针对特定蛋白的泛素化修饰实验研究中得到的。

 

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E3Net数据库 (http://pnet.kaist.ac.kr/e3net/)是当前泛素化修饰相关蛋白数据库中最为出色的,共收录了427个物种中2201个泛素化修饰E3及4896个底物蛋白信息,其中包含493个E3与1277个底物蛋白之间的1671个特异选择关系。该数据库的数据来源主要是文本挖掘方法挖掘MEDLINE摘要得到的结果、UniProt相关条目注释信息、公共泛素化数据库收录数据以及高通量实验数据。

 

图片[8]-泛素化专刊:通路调控、病理过程、药物研发和实验手段—科研工具箱-叨客学习资料网

hUbiquitome (http://bioinfo.bjmu.edu.cn/hubi/)旨在收录高可信度的实验验证的人类泛素化相关蛋白质,共收录了1个E1、12个E2、138个E3、279个底物蛋白以及17个去泛素化酶。该数据库规模较小,但可信度较高,由于收录的全部为实验验证的数据,且为人工手动录入,提高了数据库所收录数据的可靠性。

 

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2)泛素化的实验研究

 

通过高通量手段进行泛素化蛋白的检测。先提取蛋白样本后进行胰酶酶解,随后进行HPLC分级。再利用可以结合并纯化泛素化底物的抗体,富集所有被泛素化标记的蛋白片段。最后进行质谱分析、数据处理和生物信息学分析。此方法都是由专业的公司来完成的。

 

鉴定E3泛素蛋白连接酶。因只有E3泛素蛋白连接酶才具有底物识别的特异性,则在研究底物的泛素化过程时,找到并且验证E3酶是最为重要的工作。

 

而要验证底物和E3泛素蛋白连接酶之间的关系,至少需要证明两个方面:1.通过Co-IP或者酵母双杂交验证E3酶和底物之间能够相互结合;

 

2.采用体外泛素化实验(In vitro ubiquitination assay)验证E3酶能介导底物的泛素化。即在体外将E1 酶、E2 酶、E3 酶、底物和标签标记(Myc tag和His tag)的泛素分子混合后并进行孵育,再通过SDS-PAGE以及标签蛋白的抗体(myc抗体或者His抗体)来检测被泛素化标记的底物分子。

 

又因底物可被单个或多个泛素标记,而且底物上的泛素链长度有长有短,并不均一。因此通过标签抗体检测到的底物分子,往往呈现出一片smear 的形态(如图3)。

 

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图3:E3 酶介导底物泛素化的典型western 结果图。图中RHA2b是E3 酶,MYB30是底物分子。

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